一种免疫细胞在治疗癌症中应用制造技术

本发明专利技术涉及一种免疫细胞在治疗癌症中的应用。本发明专利技术制备了特异性针对PD‑L1的单克隆抗体，其具有较好的抑制肝癌细胞增殖的效果，此外，还通过分离以及优化获得了能够抑制肝癌细胞增殖的免疫细胞，通过将免疫细胞与PD‑L1细胞组合使用，可以有效的治疗肝癌，具有协同的作用，具有极好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种免疫细胞在治疗癌症中应用
本专利技术涉及生物制药领域，具体的涉及用于肝癌治疗的领域，更近一步的涉及一种免疫细胞在治疗癌症中应用。
技术介绍
肝细胞癌(HCC)占原发性肝癌的70％～80％，世界范围内是第6位常见的癌症，术后的复发以及转移引起的死亡排名第3。在亚洲国家尤其是中国和日本，在明确诊断后的数周至数月内死亡率高，5年生存率小于14％，术后5年的复发率大于50％，术后5年生存率只有30％～40％。随着医学技术的发展，免疫细胞治疗直接识别并杀伤患者血液和淋巴中的肿瘤细胞，在不损伤和破坏机体免疫系统和功能的前提下杀伤患者血液、淋巴中的肿瘤细胞，恢复并增强机体自然抗癌免疫系统。免疫细胞治疗可减轻肝癌患者的放化疗毒副作用，降低患者复发率，延长无进展生存时间和总生存期。NK(naturalkillercell，自然杀伤细胞)细胞和NKT细胞是固有免疫细胞的重要组成部分，均从骨髓衍生。在肝脏中定居的NK细胞发挥宿主免疫作用来有效阻止细胞的肿瘤化。NK细胞通过分泌细胞因子来调节其他免疫细胞的活性以及发挥细胞毒性。自然杀伤细胞(NK)占人肝脏内淋巴细胞的25％～40％，根据CD56分子的表达量可分为CD56bright和CD56dim两个亚群。其中CD56bright亚群可被IL-2刺激后扩增，约10％表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，可分泌合成TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)；而CD56dim亚群对IL-2刺激不敏感，85％的CD56dim为KIR+，分泌合成穿孔素和颗粒酶B。当HCC发生时，一方面肝癌细胞表面表达Rae1，该因子作为NK细胞活化受体NKG2D的配体可以活化NK细胞，促使其发挥抗肿瘤免疫的作用。另一方面，NK细胞的免疫功能受到限制，HCC患者外周血中CD56dimNK细胞亚群明显少于健康对照组。同时HCC患者肿瘤区域中的CD56dimNK细胞表达的IFN-γ少于非肿瘤区域，有体外实验表明这与CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)相关。肝癌发生时，细胞外基质微环境的改变、HSC分泌的TGF-β等可以抑制NK细胞活性及功能，进而使其对肝细胞的监视功能减弱。在正常的生理状态下，NK细胞通过产生“细胞溶解颗粒”来发挥生理作用，这种颗粒中包含有穿孔素、颗粒酶、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和INF-γ。NKT细胞是T淋巴细胞的一个亚群，细胞功能与T细胞和NK细胞相重合，也表达αβT细胞受体和多种NK细胞受体，是一种IL-4，IFN-γ和TNF-α等细胞因子的重要分泌源。NK细胞的抗肿瘤能力与NKG2D和MICA的表达水平密切相关。Chen等证实了蝎毒多肽(PESV)可通过调节MICA-NKG2D通路增强NK细胞的抗肿瘤能力。Jiang等也发现人IL-15基因修饰的NK细胞NKL_IL15)在HCC荷瘤小鼠中表现出较强的抑瘤活性。研究显示，RFA可有效激活HCC患者外周血中NK细胞的活性。目前已有研究表明CIK细胞联合贝伐单抗在体内外对HepG2细胞增殖、侵袭、迁移均有抑制作用，且优于单独治疗组。但是抗体应用仅限于贝伐单抗，成本较高。随着分子生物学、免疫学、基因工程等研究的不断深入，肿瘤的免疫细胞治疗得到了长足的发展和广泛的应用。然而，如何进一步提高疗效，仍然是肿瘤免疫细胞治疗所亟待解决的问题。将单抗与免疫细胞进行组合使用已经显示了治疗法可行性，为肝癌的治疗提供了新手段。但是目前研究较少。
技术实现思路
本专利技术克服了现有技术的缺陷，提供了一种免疫细胞联合单抗治疗肝癌的方法。一方面，本专利技术提供了一种特异性的PD-L1单克隆抗体，其名称为5-D4。其重链可变区序列为：QSLEESGGRLVVPDETLTITCTVSGIDLSGNFLDWVRQAPGEGLEWIGEDNKDAYTYYASWAAERLTISKPSSTKVDLKITSPTTETTATYFCGRSAFKGGTDLWGPGTLVTVSS(SEQIDNO：1)。5-D4的轻链可变区序列为：AIVMTQTPSPVSAAVGGTVTINCTESGAIYSQAYLGWFQQKPGQPPKLLIYDSSTLNCGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQFGKSNNTDGCGFGGGTEVVVR(SEQIDNO：2)。本专利技术另外一方面，提供一种免疫细胞的制备方法，具体包括以下步骤：(a)将刺激因子包被培养瓶；其中刺激因子由IL-2浓度5000IU/mL、IFN-γ浓度5000IU/mL、IL-15浓度2000IU/mL、GM-CSF浓度2000IU/mL、IL-4浓度750IU/mL、TNF-α浓度1000IU/mL以生理盐水配置组成。(b)将血液采用密度梯度离心法分离单个核细胞；(c)在刺激因子包被的培养瓶中添加含有亚油酸2mg/L，氨基酸20mg/L，维生素50mg/L、IL-2浓度5000IU/mL、IFN-γ浓度5000IU/mL的RPMI1640培养基，再将单个核细胞接种于刺激因子包被的培养瓶中在37℃、二氧化碳浓度5％条件下进行培养，其中单个核细胞的接种浓度为5×106个/ml；(d)待培养3天后，将单个核细胞移入空培养瓶中，再向空培养瓶中添加含有亚油酸2mg/L，氨基酸20mg/L，维生素50mg/L、IL-2浓度5000IU/mL、IFN-γ浓度5000IU/mL的RPMI1640培养基继续在37℃、二氧化碳浓度5％条件下进行培养；(e)待培养7天后，将单个核细胞移入培养袋中，再向培养袋中添加含有亚油酸2mg/L，氨基酸20mg/L，维生素50mg/L、IL-2浓度5000IU/mL、IFN-γ浓度5000IU/mL的RPMI1640培养基在37℃、二氧化碳浓度5％条件下进行培养，待培养15天后，收集单个核细胞。采用流式细胞检测方法对步骤(e)中收集的单个核细胞中NK免疫细胞(CD3-CD56+)的含量进行检测。本专利技术另外一方面，提供一种药物组合物，其含有分离的免疫细胞以及所述的PD-L1单克隆抗体。跟进一步的，抗PD-L1抗体或其PD-L1-结合功能片段可单独配制成药物组合物，该药物组合物适于通过预期的给药途径给予靶受试者，如下文更详细地讨论的。适用于本文所述方法的药物组合物可包括治疗活性剂(例如抗PD-L1抗体或其功能片段)和药学上可接受的载体或稀释剂。该组合物可制成静脉内，皮下，腹膜内，肌肉内，口服，鼻，肺，眼，阴道或直肠给药。在一些实施例中，配制抗PD-L1抗体或其功能性片段用于静脉内，皮下，腹膜内或肌肉内给药，例如溶液，悬浮液，乳剂，脂质体制剂等。药物组合物可使用本领域已知的技术配制成速释组合物，缓释组合物，延迟释放组合物等。用于各种剂型的药理学上可接受的载体是本领域已知的。例如，用于固体制剂的赋形剂，润滑剂，粘合剂和崩解剂是已知的；用于液体制剂的溶剂，增溶剂，悬浮剂，等渗剂，缓冲剂和安抚剂是已知的。在一些实施方案中，药物组合物包括一种或多种附加组分，例如一种或多种防腐剂，抗氧化剂，稳定剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性结合PD-L1的单克隆抗体，其名称为5-D4，其特征在于：重链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种特异性结合PD-L1的单克隆抗体，其名称为5-D4，其特征在于：重链可变区序列如SEQIDNO：1所示，轻链可变区序列如SEQIDNO：2所示。


2.一种药物组合物，其含有权利要求1所述的单克隆抗体以及提取的免疫细胞，所述的免疫细胞为采用下述方法制备得到：
(a)将刺激因子包被培养瓶；其中刺激因子由IL-2浓度5000IU/mL、IFN-γ浓度5000IU/mL、IL-15浓度2000IU/mL、GM-CSF浓度2000IU/mL、IL-4浓度750IU/mL、TNF-α浓度1000IU/mL以生理盐水配置组成；
(b)将血液采用密度梯度离心法分离单个核细胞；
(c)在刺激因子包被的培养瓶中添加含有亚油酸2mg/L，氨基酸20mg/L，维生素50mg/L、IL-2浓度5000IU/mL、IFN-γ浓度5000IU/mL的RPMI1640培养基，再将单个核细胞接种于刺激因子包被的培养瓶中在37℃、二氧化碳浓度5％条件下进行培养，其中单个核细胞的接种浓度为5×106个/ml；
(d)待培养3天后，将单个核细胞移入空培养瓶中，再向空培养瓶中添加含有亚油酸2mg/L，氨基酸20mg/L，维生素50mg/L、IL-2浓度5000IU/mL、IFN-γ浓度5000IU/mL的RPMI1640培养基继续在37℃、二氧化碳浓度5％条件下进行培养；
(e)待培养7天后，将单个核细胞移入培养袋中，再向培养袋中添加含有亚油酸2mg/L，氨基酸20mg/L，维生素50mg/L、IL-2浓度5000IU/mL、IFN-γ浓度5000IU/mL的RPMI1640培养基在37℃、二氧化碳浓度5％条件下进行培养，待培养15天后，收集单个核细胞。


3.权利要求1所述的单克隆抗体以及免疫细胞在制备用于治疗肝癌的药物组合物中的用途；其中所述免...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘欢，朱小明，
申请(专利权)人：北京广未生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11