一种靶向Frizzled7人源化抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种靶向Frizzled7人源化抗体及其制备方法与应用。所述靶向Frizzled7人源化抗体具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.11所示，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。本发明专利技术的靶向Frizzled7人源化抗体SHH002‑hu1保留了鼠源单抗SHH002与重组人Fzd7蛋白的高亲和力(KD值均小于1×10

【技术实现步骤摘要】
一种靶向Frizzled7人源化抗体及其制备方法与应用本申请是分案申请，本分案申请的母案申请日为2019年11月6日，申请号为201911078254.4，专利技术名称为“一种靶向Frizzled7人源化抗体及其制备方法与应用”。
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种靶向Frizzled7人源化抗体及其制备方法与应用。
技术介绍
Wnt信号通路是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路，其在动物胚胎的早期发育、器官形成和肿瘤的发生发展中，发挥至关重要的作用。Wnt蛋白家族与受体Frizzled(Fzd)的N端胞外结构区CRD(cysteine-richdomain)结合，与Dvl(disheveled)蛋白相互作用并激活下游信号通路。Fzd蛋白是一类具有七次跨膜分子结构的Wnt受体家族，该家族中有10个成员蛋白，Frizzled-7(Fzd7)为成员之一。研究表明Wnt受体Fzd7异常表达于不同种类的癌症中(包括三阴性乳腺癌(TNBC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肝癌(HCC)等)(PolakisP,2012,EMBOJ,31:2737-46；KingTDetal,2012,JCellBiochem,113:13-8)；Fzd7通过激活经典Wnt通路(Wnt/β-catenin)来诱导肿瘤的发生和转移。Wnt通路参与肿瘤的侵袭和转移，且对肿瘤血管生成也有调节作用，对Fzd7进行基因敲除可以显著抑制肿瘤细胞增殖、移植瘤生长及血管新生。Wnt信号和肿瘤干细胞行为也存在密切联系，Fzd7就是肿瘤干细胞标记物之一，且这些肿瘤干细胞中Fzd7的上调与肿瘤化疗耐受以及病人的低生存率显著相关(BarkerNetal.,2009,Nature,457:608-11)。另外Fzd7的“context-specificfunctions”暗示了选择性靶向Fzd7可以在不影响正常组织稳态的前提下治疗癌症。综上，Fzd7是多种肿瘤的潜在治疗靶点(KahnM,2014,NatRevDrugDiscov,13:513-32)。目前靶向Fzd7方法主要有RNA干扰、小分子抑制剂、小干扰肽、可溶性重组Fzd7蛋白以及抗Fzd7单抗。Fzd7shRNA可以有效抑制TNBC细胞的增殖侵袭及肿瘤生长；小干扰肽RHPDs或小分子抑制剂FJ9干扰Fzd7和分散蛋白(Dvl)的结合来阻断Wnt信号，并有效抑制小鼠移植瘤的生长(NambotinSBetal.,2011,JHepatol,54:288-99；FujiiNetal.,2007,CancerRes,67:573-9)；使用Fzd7的胞外区重组蛋白(sFzd7)与细胞表面Fzd7竞争性结合Wnt3配体来阻断Wnt/β-catenin信号也并抑制肿瘤发生发展(WeiWetal.,2011,MolCancer,10:16)；以上几种方法目前仍处于临床前研究阶段。相比之下，更利于临床转化的方法是利用抗体来特异性靶向Fzd7，OncoMed公司已经开发出了一种靶向Fzd7CRD结构域的单抗OMP-18R5(vantictumab)，目前正处于晚期非小细胞肺癌(NSCLC)、晚期HER2(人表皮生长因子受体2)阴性乳腺癌以及晚期胰腺癌的Ⅰ期临床试验中(FlanaganDJetal.,2019,CancerRes,79:970-81；GurneyAetal.,2012,ProcNatlAcadSciUSA,109:11717-22)。OMP-18R5还与Fzd受体家族中的Fzd1、Fzd2、Fzd5和Fzd8有交叉反应，预示OMP-18R5可能被用于多种癌症的治疗，但是对靶标蛋白特异性的缺失可能会导致脱靶效应而影响抗体的功效。Wnt蛋白家族与Fzd的N端胞外结构区CRD(cysteine-richdomain)特异性结合，与Dvl蛋白相互作用并激活下游信号通路。Fzd的CRD在与配体结合中发挥至关重要的作用，Fzd受体家族该区域序列不管在种属间还是跨种属都高度保守。Fzd7的CRD区序列与Fzd家族其他成员均有超过40％的同源性，特别是与Fzd1和Fzd2，同源性达到近80％(Janda,CYetal.,2012,Science,337:59-63)。选择Fzd7CRD段为抗原筛选得到的抗体，可以阻断Fzd与其配体结合的关键位点，但其也有可以与Fzd家族其他成员结合的几率，尤其是Fzd1/2，因此该类抗体在治疗过程中会出现脱靶风险(OMP-18R5即是以Fzd7CRD段蛋白为抗原筛选得到的抗体)。若筛选到仅特异性靶向某一Fzd受体的抗体，不仅可以降低脱靶效应增强抗肿瘤活性，还可以作为强大的工具来研究各Fzd受体的“context-specificroles”，进而来阐明Wnt信号通路及其作用机制。相较于抗体Fab片段、单链抗体(scFv)以及纳米抗体(Nanobody)，IgG样全长抗体(Full-lengthAntiody)具有完整的抗体结构，性质稳定，体内半衰期长，除了可以阻断靶标信号通路还可以发挥Fc片段介导的ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用)、CDC(补体依赖的细胞毒性作用)等免疫效应。2014-2018上市的43个抗体类药物中仅有1个人源Fab片段和1个纳米抗体，除了少数Fc融合蛋白和抗体偶联药物(ADC)外，几乎均为全长抗体，显示出了全长抗体卓越的临床和药物价值。在常用的抗体筛选技术中，杂交瘤技术筛选获得的鼠源全长抗体具有较高的亲和力。但是鼠源抗体在临床应用中会使患者产生人类抗小鼠抗体反应(HAMA)；将鼠源抗体的可变区(V区)基因与人抗体的恒定区(C区)基因拼接为嵌合抗体基因，表达出的嵌合抗体降低了患者发生HAMA的风险；进一步将鼠源抗体的互补决定区(CDR区)移植到人的可变域中而开发的人源抗体，则进一步降低嵌合抗体中针对小鼠可变区域基因产生抗药物抗体(ADA)反应的风险。抗体人源化设计中通常选择IgG1或者IgG4两个亚型的抗体为模板，其Fc端可根据其生理学机理，通过位点突变或者去糖基化等进一步增强或者削弱ADCC，CDC等细胞免疫活性。在抗体V区中，起支架作用的框架区(FR区)不仅提供了CDR的空间构象环境，还会参加抗体结合位点正确构象的形成。因此，简单的CDR移植往往会丧失或降低原抗体的亲和力(JonesPTetal.,1986,Nature,321:522-5；Al-LazikaniBetal.,1997,JMolBiol,273:927-48)。应用生物信息学软件Discoverystudio设计鼠源FR区非关键氨基酸人源化突变可以有效降低抗体亲和力丢失风险。应用抗体数据库和生物信息学软件进行人源化设计的优势主要在于：1、根据重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的序列搜索HumanGermline数据库，分别选择与VH和VL同源性最高的序列作为人源化设计模板；2、通过Discoverystudio软件对鼠源抗体进行结构模拟，挑选可信度最高的模拟结果指导人源化设计，保留对抗体结构稳定性起关键作用的鼠源氨基酸，并依据模板将不重要的位点突变为人源氨基酸。该方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向Frizzled7人源化抗体，其特征在于，所述靶向Frizzled7人源化抗体具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.13所示，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种靶向Frizzled7人源化抗体，其特征在于，所述靶向Frizzled7人源化抗体具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列如SEQIDNo.13所示，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNo.14所示。


2.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求1所述抗体；以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。


3.一种核苷酸，其特征在于，所述核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如权利要求1所述的抗体；或(2)如权利要求2所述的重组蛋白。


4.一种表达载体，其特征在于，含有如权利要求3所述核苷酸。

【专利技术属性】
技术研发人员：解伟，黄钢，王进，张坤驰，孙吉，张艳，王风仙，赵慧杰，黄燕娟，
申请(专利权)人：上海健康医学院，
类型：发明
国别省市：上海;31