一种口腔幽门螺旋杆菌检测试剂盒及其应用方法技术

本发明专利技术涉及生物化学相关技术领域，具体涉及一种口腔幽门螺旋杆菌检测试剂盒及其应用方法。其技术要点如下：包括独立包装的抗试剂A、抗试剂B、磁性碳量子点试剂、校准品、质控品、清洗液和发光底物；其中，磁性荧光纳米碳量子点试剂是Fe

【技术实现步骤摘要】
一种口腔幽门螺旋杆菌检测试剂盒及其应用方法
本专利技术涉及生物化学相关
，具体涉及一种口腔幽门螺旋杆菌检测试剂盒及其应用方法。
技术介绍
幽门螺杆菌已成为世界范围内对人类健康的威胁。考虑到口腔是幽门螺杆菌的潜在胃外储库，可能是感染源，再感染和传播途径，研究人员还努力探索H.pylori感染与口腔疾病之间的关系。口腔幽门螺杆菌患病率高的牙周炎患者，牙周健康状况差，牙周袋先进，牙龈和牙龈出血现象。一项回顾性研究也表明幽门螺杆菌感染的儿童患龋的风险增加。且大量报道都表明定植在口腔中的细菌对人体的影响范围已远远超越它们的原本定植地。而幽门螺旋杆菌作为一种微需氧的革兰阴性螺杆菌可以在大多数的慢性胃炎患者的口腔中发现，胃部幽门螺旋杆菌反复发作无法根除也被证明与口腔定植有关。口腔存在多位点适于幽门螺杆菌生存，如牙菌斑和牙周袋，作为胃部细菌的储水库，口腔细菌是发生胃炎的危险因素，引起胃炎反复发作和迁延不愈，长期刺激引起胃粘膜的增生分化，进而引发胃癌。而现有技术针对幽门螺旋杆菌的治疗集中在胃部，对口腔的幽门螺旋杆菌的检测和治疗一直被人们忽视，这样间接影响了幽门螺旋杆菌的治疗效果。忽视口腔幽门螺旋杆菌的治疗的主要原因是，口腔内的菌落组成比胃部的菌落组成更加复杂，幽门螺旋杆菌的丰都小，现有的检测手段难以快速准确的对口腔内的幽门螺旋杆菌进行检测。有鉴于上述现有的口腔幽门螺旋杆菌检测技术中存在的缺陷，本专利技术人基于从事此类产品设计制造多年丰富的实务经验及专业知识，并配合学理的运用，积极加以研究创新，以期创设一种口腔幽门螺旋杆菌检测试剂盒及其应用方法，通过磁性荧光碳量子点将电化学发光技术和细菌检测手段结合起来，达到准确、快速检测口腔内幽门螺旋杆菌的目的。经过不断的研究、设计，并经反复试作样品及改进后，终于创设出确具实用价值的本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种口腔幽门螺旋杆菌检测试剂盒，通过磁性荧光碳量子点将电化学发光技术和细菌检测手段结合起来，达到准确、快速检测口腔内幽门螺旋杆菌的目的。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：本专利技术的作用原理是：异硫氰酸荧光素(FITC)标记的HP抗原与碱性磷酸酶(AP)标记的HP抗原和样本、校准品或质控品中的HP抗体结合形成“三明治”复合物。随后加入连有抗FITC抗体的磁性荧光纳米碳量子点，通过抗FITC抗体与FITC的特异性结合使抗原抗体免疫复合物结合在磁性荧光纳米碳量子点上。在外加磁场的作用下，将免疫反应形成的复合物与未结合的其他物质分离，清洗复合物后，加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时发出光子，形成发光反应，即可使用化学发光仪检测反应的发光强度。在检测范围内，发光强度与样本中的HP抗体的含量成正比，使用改良的四参数Logistic方程拟合可计算出样本中HP抗体浓度。本专利技术提供的一种口腔幽门螺旋杆菌检测试剂盒，包括独立包装的抗试剂A、抗试剂B、磁性碳量子点试剂、校准品、质控品、清洗液和发光底物；其中，磁性荧光纳米碳量子点试剂是Mn2B3@C@CdTe复合试剂或Fe2B3@C@CdTe复合试剂中的任意一种。其中，Mn2B3@C@CdTe复合试剂或Fe2B3@C@CdTe复合试剂中的B能够与酶产生“天线效应”，并通过此种协同效应还可以将它们所吸收的激发能量有效地同时传递给发光底物的激发态，使其具有发光谱带宽、色纯度高、激发态寿命长、吸收激发能量强、转换效率高等优点，其发光强度远高于传统发光材料，进而提高本专利技术的检测效率和准确度。进一步的，抗试剂A是包括异硫氰酸荧光素标记的幽门螺旋杆菌抗体连接物和WO3-MoO3的BSA缓冲溶液。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时发出光子，磁性微球的磁性改变，形成发光反应，即可使用化学发光仪检测反应的发光强度，而此时，WO3-MoO3由于磁性微球的磁性改变导致微弱电磁场产生，致使WO3-MoO3颜色发生变化，有效的提高了本专利技术检测方法的灵敏度，即使在唾液中，幽门螺旋杆菌的丰度小，也可以发生更加明显的颜色变化。进一步的，抗试剂B是包括碱性磷酸酶标记的幽门螺旋杆菌抗原连接物的BSA的缓冲溶液。进一步的，抗试剂A通过下列方法制备：S1.采用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0~5.0mg/ml的异硫氰酸荧光素溶液；S2.向幽门螺旋杆菌抗体中加入幽门螺旋杆菌抗体质量1.1~1.5倍的所述异硫氰酸荧光素溶液并充分混合；S3.用pH为8~9的碳酸盐缓冲液调节pH平衡，再用凝胶层析分离纯化值得异硫氰酸荧光素标记的幽门螺旋杆菌抗体包被抗体。进一步的，抗试剂B的制备方法如下：A1.用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.5~5.0mg/ml的碱性磷酸酶溶液；A2.用幽门螺旋杆菌抗原和碱性磷酸酶分别将反应基团分别活化，然后按照摩尔比为碱性磷酸酶：幽门螺旋杆菌抗原1:1~1:3的比例在催化剂的催化下充分混匀进行偶联反应；A3.使用pH为8~9的Tris缓冲溶液调节pH平衡，再用凝胶柱分离纯化制得碱性磷酸酶标记的幽门螺旋杆菌抗原连接物。进一步的，磁性荧光纳米碳量子点试剂是包括抗异硫氰酸荧光素抗FITC与磁性荧光纳米碳量子点与PTCA偶联物的BSA缓冲溶液。进一步的，磁性荧光纳米碳量子点试剂的制备方法如下：P1.将磁性荧光纳米碳量子点溶于PTCA溶液中；P2.向步骤P1中加入体积为PTCA溶液的2~5倍的BSA缓冲溶液，搅拌均匀；P3.向步骤P2中加入质量分数为0.8~1.2%的抗异硫氰酸荧光抗FITC，在2~8℃内保持混匀状态反应16~20h；P4.将所得溶液在磁场中放置12~18min，待磁性荧光纳米碳量子点试剂颗粒沉降后用BSA缓冲溶液对其进行清洗，然后定容至8~12mg/ml，保存待用。进一步的，磁性荧光纳米碳量子点试剂的制备方法中，在步骤P4后，利用光量子发射装置对磁性荧光纳米碳量子点试剂进行量子干涉。在光量子发射装置对其进行干涉后，磁性荧光纳米碳量子点内部金属的最外层电子轨道已经发生了能级跃迁，跃迁到激发态，发光底物产生的不稳定的激发态中间体协同作用回到基态，释放出光量子，提高发光强度，进而提高了本专利技术检测方法的靶向性。进一步的，校准品和质控品通过包括以下步骤的操作制备而成：在1L的含BSA缓冲液中加入0.01~0.05g四环素和0.1~0.5g的硫酸新霉素，然后加入幽门螺旋杆菌抗体并充分溶解。进一步的，发光底物是ALPS溶于缓冲溶液制备而成。本专利技术的第二个目的是提供一种口腔幽门螺旋杆菌检测试剂盒的应用方法，具有同样的技术效果。其技术效果是通过下述技术方案实现的。本专利技术提供一种口腔幽门螺旋杆菌检测试剂盒的应用方法，包括如下操作步骤：B1.分别取5~10μL校准品、质控品和待测样本；B2.分别向上述三种样品中加入5~10μL抗试剂A和5~10μL抗试本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种口腔幽门螺旋杆菌检测试剂盒，其特征在于，包括独立包装的抗试剂A、抗试剂B、磁性荧光碳量子点试剂、校准品、质控品、清洗液和发光底物；其中，所述磁性荧光纳米碳量子点试剂是Mn

【技术特征摘要】
1.一种口腔幽门螺旋杆菌检测试剂盒，其特征在于，包括独立包装的抗试剂A、抗试剂B、磁性荧光碳量子点试剂、校准品、质控品、清洗液和发光底物；其中，所述磁性荧光纳米碳量子点试剂是Mn2B3@C@CdTe复合试剂或Fe2B3@C@CdTe复合试剂中的任意一种。


2.根据权利要求1所述的一种口腔幽门螺旋杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述抗试剂A是包括异硫氰酸荧光素标记的幽门螺旋杆菌抗体连接物的BSA缓冲溶液。


3.根据权利要求1或2所述的一种口腔幽门螺旋杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述抗试剂B是包括碱性磷酸酶标记的幽门螺旋杆菌抗原连接物的BSA的缓冲溶液。


4.根据权利要求1所述的一种口腔幽门螺旋杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述抗试剂A通过下列方法制备：
S1.采用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0~5.0mg/ml的异硫氰酸荧光素溶液；
S2.向幽门螺旋杆菌抗体中加入所述幽门螺旋杆菌抗体质量1.1~1.5倍的所述异硫氰酸荧光素溶液并充分混合；
S3.用pH为8~9的碳酸盐缓冲液调节pH平衡，再用凝胶层析分离纯化值得异硫氰酸荧光素标记的幽门螺旋杆菌抗体包被抗体。


5.根据权利要求1所述的一种口腔幽门螺旋杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述抗试剂B的制备方法如下：
A1.用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.5~5.0mg/ml的碱性磷酸酶溶液；
A2.用幽门螺旋杆菌抗原和碱性磷酸酶分别将反应基团分别活化，然后按照摩尔比为碱性磷酸酶：幽门螺旋杆菌抗原1:1~1:3的比例在催化剂的催化下充分混匀进行偶联反应；
A3.使用pH为8~9的Tris缓冲溶液调节pH平...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈慧霞，王林，韩晓，李媛，谢慧，黄优，夏文倩，
申请(专利权)人：南京医科大学附属口腔医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32