作为疫苗设计的表位选择工具的哺乳动物MHC肽展示制造技术

本发明专利技术涉及一种用于鉴定由主要组织相容性复合物(MHC)呈递的候选肽的方法，用于疫苗接种、诱导免疫耐受、阻断TCR、MHC介导的毒素递送和用CAR重定向T细胞，用于免疫原性测试和其他体外T细胞反应性测试。本发明专利技术进一步涉及用于确定候选肽的MHC结合亲和力的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】作为疫苗设计的表位选择工具的哺乳动物MHC肽展示本专利技术涉及一种用于鉴定由主要组织相容性复合物(MHC)呈递的候选肽的方法，用于体内和/或体外干预，包括疫苗接种、诱导免疫耐受、阻断TCR和MHC介导的毒素递送，用于免疫原性测试和其他体外T细胞反应性测试。T细胞在免疫系统中起着核心作用。T细胞的功能主要取决于由抗原呈递细胞(APC)呈递的肽中包含的表位的识别。APC几乎可以是任何有核细胞类型，但是专业的APC例如树突状细胞(DC)在呈递中特别有效。存在具有不同功能的不同T细胞集合，特别是分别识别由专业APC呈递的MHCII结合表位或由大多数细胞类型呈递的MHCI结合表位的CD4+T细胞或CD8+T细胞。MHC分子在以短线性肽形式向T细胞呈递细胞抗原或表位方面起着重要作用。MHC由α链和β链以及结合在由这些链形成的凹槽中的肽组成。该复合物的稳定性高度依赖于肽结合，因此空的MHC分子从细胞表面被下调并降解。然而，空的MHC分子存在于细胞表面，且可以结合细胞外肽并将其呈递到T细胞。此外，有人描述了空的MHC的两种不同的异构体(Rabunowitz等人,Immunity,9,699–709(1998))：较不稳定的活性异构体和较稳定的非活性异构体。个体的MHC目录(MHCrepertoire)是多基因的而MHC基因是高度多态的。因此，个体可以表达的MHC的集合很可能与另一个随机个体的集合非常不同。携带MHC的肽与在T细胞表面的T细胞受体(TCR)相互作用，从而导致T细胞活化。APC，例如树突状细胞或巨噬细胞，可以通过吞噬作用或受体介导的内吞作用使抗原内在化。为了控制T细胞的活性，重要的是确定它们的特异性肽配体并控制或调节MHC-肽复合物与TCR间的相互作用。因此，重要的是确定肽与MHC的结合亲和力。合适的肽或MHC-肽复合物可用于多种应用。它们可用于例如鉴定或富集反应性T细胞或用于体外免疫原性测试。它们也可用于阻断TCR，体内递送毒素到T细胞或用含MHC的嵌合抗原受体MHC-CAR重定向T细胞(Jyothi等人,Nat.Biotech,20,1215–1220(2002))，以诱导对表位的免疫耐受(否则所述表位将活化对该表位具有特异性的T细胞)。疫苗，特别是活化T细胞以消除癌细胞的基于肿瘤特异性抗原(TSA)的癌症疫苗的开发是现代医学的主要目标之一。肿瘤特异性肽，即所谓的新抗原(neoantigen)，仅存在于肿瘤细胞中，而在正常组织中完全不存在。此类肿瘤特异性肽由导致形成新蛋白质序列的肿瘤特异性DNA改变产生。由于不同肿瘤内和不同肿瘤间的细胞的遗传异源性，即使它们起源于同一器官，存在于患者的肿瘤中的一组新抗原在很大程度上也对该患者具有特异性。在MHC的背景下，肿瘤特异性肽被展示(display)在肿瘤细胞和所谓的抗原呈递细胞(APC)的表面上。一旦肿瘤特异性肽在细胞表面呈递，它们就可以被免疫系统识别和破坏。因此，含有肿瘤特异性肽的疫苗可以刺激免疫系统以检测和破坏在其表面呈递这些分子的癌细胞。最近，已经有人证明由肿瘤中积累的体细胞突变引起的TSA经常被肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)识别(Linnemann等人,NatMed1-7(2014))。肿瘤DNA的外显子组测序以及与来自健康组织的DNA比较可以发现对患者的肿瘤细胞特异的此类体细胞突变。然而，通常会检测到许多突变(Vormehr等人,CurrOpinImmunol39,14–22(2016))，但由于技术问题，同时也是为了使自身免疫的风险最小化，一种疫苗中仅应混合少量TSA(即肿瘤特异性肽)。这些TSA的选择至关重要，因为抗原呈递细胞(APC)不会在其MHC分子上呈递所有可能的肽，而是呈递适合对患者特异的特定MHC等位基因的子集。对于许多涉及T细胞的应用，选择可以由APC有效呈递的肽，特别是肿瘤特异性肽是至关重要的且对于肿瘤疫苗设计仍然是瓶颈。为了解决这个问题，候选肽通常根据其MHC结合亲和力进行排名，这些亲和力是借助于生物信息学分析预测的(Sahin等人,Nature1–19(2017)；Ott等人,Nature547,217–221(2017))。然而，最近的数据表明，对于肽呈递的生物信息学预测效果相当差，特别是对于MHCII类表位(Sofron等人,EurJImmunol46,319–328(2015))。已经有人公开了使用抗原呈递报告细胞系测量T细胞与MHC-肽复合物(经由其TCR)的结合的“湿实验室”方法；WO2016097334A1。该报告细胞系表达包含MHC-肽复合物的嵌合抗原受体，该MHC-肽复合物在与T细胞的TCR结合后活化报告细胞系中的报告基因。间接地，也用该方法测量MHC-肽复合物的稳定性，因为只有足够稳定的MHC-肽复合物会出现在报告细胞系的表面，与T细胞相互作用并最终活化报告子。然而，该方法不允许具体测量MHC-肽复合物的稳定性，因为报告基因的活化还取决于TCR对肽表位的亲和力和其他免疫调节因子。因此，需要提供可靠地确定由APC有效呈递的肽，特别是TSA的装置和方法。现在，本专利技术满足了这种需求，因为它提供了在权利要求书和本专利技术的以下实施方式中更具体地定义的这样的装置和方法。在其主要方面，本专利技术涉及：1.一种用于鉴定由主要组织相容性复合物(MHC)呈递的候选肽的方法，所述方法包括在报告细胞系中表达包含共价结合的候选肽的重组MHC-肽复合物，检测显示MHC-肽复合物的表面表达的报告细胞，和确定在细胞表面呈递的候选肽的序列。2.根据方面1所述的方法，所述方法包括(i)产生包含候选肽的库，所述候选肽克隆在重组MHCβ链和/或α链上游并与其同框(in-frame)；(ii)将这种库与相应的MHCα链和/或β链一起转导到合适的报告细胞系中；(iii)检测和分离在细胞表面上表达一种或多种MHC-肽复合物的细胞；(iv)从在其细胞表面上呈递一种或多种MHC-肽复合物的细胞中分离DNA；(v)确定由整合在从在细胞表面上呈递MHC-肽复合物的细胞分离的所述DNA中的载体编码的候选肽的序列。3.一种用于鉴定由主要组织相容性复合物(MHC)呈递的候选肽的方法，所述方法包括在报告细胞系中表达包含共价结合的候选肽的重组MHC-肽复合物，检测显示MHC-肽复合物的表面表达的报告细胞，和确定MHC-肽复合物的表面表达的水平，以及在细胞表面呈递的候选肽的序列。4.根据方面3所述的方法，所述方法包括(i)产生包含候选肽的库，所述候选肽克隆在重组MHCβ链和/或α链上游并与其同框；(ii)将这种库与相应的MHCα链和/或β链一起转导到合适的报告细胞系中；(iii)检测和分离在细胞表面上表达一种或多种MHC-肽复合物的细胞；(iv)确定所述一种或多种MHC-肽复合物的细胞表面表达的水平；(v)从在其细胞表面上呈递一种或多种MHC-肽复合物的细胞中分离DNA；(vi)确定由整合在从在细胞表面上呈递MHC-肽复合物的细胞分离的所述DNA中的载体编码的候选肽的序列。5.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴定由主要组织相容性复合物(MHC)呈递的候选肽的方法，所述方法包括在报告细胞系中表达包含共价结合的候选肽的重组MHC-肽复合物，检测显示MHC-肽复合物的表面表达的报告细胞，和确定在细胞表面呈递的候选肽的序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180412 EP 18167050.61.一种用于鉴定由主要组织相容性复合物(MHC)呈递的候选肽的方法，所述方法包括在报告细胞系中表达包含共价结合的候选肽的重组MHC-肽复合物，检测显示MHC-肽复合物的表面表达的报告细胞，和确定在细胞表面呈递的候选肽的序列。


2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括
(i)产生包含候选肽的库，所述候选肽克隆在重组MHCβ链和/或α链上游并与其同框；
(ii)将这种库与相应的MHCα链和/或β链一起转导到合适的报告细胞系中；
(iii)检测和分离在细胞表面上表达一种或多种MHC-肽复合物的细胞；
(iv)从在其细胞表面上呈递一种或多种MHC-肽复合物的细胞中分离DNA；
(v)确定由整合在从在细胞表面上呈递MHC-肽复合物的细胞分离的所述DNA中的载体编码的候选肽的序列。


3.一种用于鉴定由主要组织相容性复合物(MHC)呈递的候选肽的方法，所述方法包括在报告细胞系中表达包含共价结合的候选肽的重组MHC-肽复合物，检测显示MHC-肽复合物的表面表达的报告细胞，和确定MHC-肽复合物的表面表达的水平，以及在细胞表面呈递的候选肽的序列。


4.根据权利要求3所述的方法，所述方法包括
(i)产生包含候选肽的库，所述候选肽克隆在重组MHCβ链和/或α链上游并与其同框；
(ii)将这种库与相应的MHCα链和/或β链一起转导到合适的报告细胞系中；
(iii)检测和分离在细胞表面上表达一种或多种MHC-肽复合物的细胞；
(iv)确定所述一种或多种MHC-肽复合物的细胞表面表达的水平；
(v)从在其细胞表面上呈递一种或多种MHC-肽复合物的细胞中分离DNA；
(vi)确定由整合在从在细胞表面上呈递MHC-肽复合物的细胞分离的所述DNA中的载体编码的候选肽的序列。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述MHC分子是MHCII类分子，其包含细胞外MHCII类α链和跨膜结构域，以及细胞外MHCII类β链和跨膜结构域。


6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述MHC分子是MHCI类分子，其包含细胞外MHCI类α链和跨膜结构域以及β-2微球蛋白。


7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述MHC-肽复合物是包含候选肽、β-2巨球蛋白、细胞外MHCI类α链和跨膜结构域的融合蛋白。


8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述MHCα链携带Y84A突变。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中MHC分子的各链包含跨膜结构域。


10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述跨膜结构域是所述MHC分子的天然跨膜结构域。


11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述跨膜结构域是异源分子如TCRα/β、TCRγ/δ、CD3γ/δ/ε/ζ、CD4或CD8α/β的跨膜结构域。


12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：简·基斯洛，弗朗茨·约瑟夫·奥伯迈尔，曼弗雷德·科普夫，
申请(专利权)人：苏黎世联邦理工学院，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH