一种大丽轮枝菌内共生菌短波单胞菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种大丽轮枝菌内共生菌短波单胞菌及其应用，命名为大丽轮枝菌内共生菌短波单胞菌(Brevundimonas olei dahliae olei)，其保藏号为CCTCC NO：M 2020392。采用形态学鉴定、多样性测序分析确定该菌株为Brevundimonas olei dahliae olei，通过共培养实验探究B.olei发酵液对大丽轮枝菌生长及微菌核的影响。扫描电镜观察，随培养时间及发酵液浓度增加大丽轮枝菌分生孢子形成减少，菌丝形态发生膨胀、破裂、异型，微菌核逐渐减少消失，该研究证明共生B.olei对大丽轮枝菌有较好抑菌活性。

【技术实现步骤摘要】
一种大丽轮枝菌内共生菌短波单胞菌及其应用
本专利技术涉及微生物种质资源的开发与利用
具体地说是一种大丽轮枝菌内共生菌短波单胞菌及其应用。
技术介绍
微生物与其他个体之间存在着复杂的共生关系，这种共生现象广泛存在于微生物与微生物之间，微生物与植物、微生物与动物。共生菌是自然界中存在的普遍现象，且共生菌宿主类型多样，能与不同动物、植物、珊瑚、大型真菌、蚜虫、藻类等寄主共生，参与或者决定宿主某些特性。共生菌能为植物固氮、能为植物提供营养、能参与宿主次生代谢的合成、能协助宿主适应极端环境，共生菌分泌多种活性物质促进或破坏宿主生长，改变宿主的表型和代谢。据相关文献报道，病原菌内共生菌与病原菌致毒致病性有一定关联，尤其是水稻立枯病的病原菌根霉菌，其毒素的产生是由其内共生菌-伯克霍尔德菌产生而导致水稻病害发生，Fusarium对尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)的拮抗作用不是其本身，而是Fusarium的共生体。棉花黄萎病主要是由大丽轮枝菌引起的土传真菌维管束病害，严重影响连作棉田产量及棉花品质，制约了棉花产业健康持续发展，由大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病是否存在此类共生关系未见相关报道。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种大丽轮枝菌内共生菌短波单胞菌及其应用。为解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：一种大丽轮枝菌内共生菌短波单胞菌，命名为大丽轮枝菌内共生菌短波单胞菌(Brevundimonasoleidahliaeolei)，其保藏号为CCTCCNO：M2020392。一种微生物制剂，含权利要求1所述的短波单胞菌(Brevundimonasoleidahliaeolei)的无菌培养液。上述微生物制剂，将短波单胞菌(Brevundimonasoleidahliaeolei)接种于LB培养基中，37℃，180r·min-1，培养16-24h，6000r·min-1离心10min，取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌2-3次，分装，置于4℃冰箱保存备用，得到微生物制剂。上述微生物制剂，短波单胞菌(Brevundimonasoleidahliaeolei)加入LB培养基后，短波单胞菌(Brevundimonasoleidahliaeolei)的质量浓度为10％-50％。上述大丽轮枝菌内共生菌短波单胞菌在防治植物真菌病害中的应用，所述真菌为大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)。上述大丽轮枝菌内共生菌短波单胞菌在防治棉花黄萎病上的应用。本专利技术的技术方案取得了如下有益的技术效果：采集南疆棉区发病棉田黄萎病株，从中分离大丽轮枝菌，通过破壁分离，从大丽轮枝菌中分离出一株内共生菌，鉴定为油单胞菌(Brevundimonasoleidahliaeolei)，油单胞菌的存在是否对大丽轮枝菌的繁殖体和致病性产生影响，是本专利技术研究的主要目的。采用形态学鉴定、多样性测序分析确定该菌株为Brevundimonasoleidahliaeolei。离体实验：取B.olei菌液及无菌发酵液通过共培养方式探究该菌株对大丽轮枝菌形态及抑菌率影响，研究发现不同浓度B.olei菌液、发酵液均对大丽轮枝菌产生抑制作用。共培养15d，50％浓度的B.olei菌液可以完全抑制微菌核产生，使得大丽轮枝菌由原来菌核型转变为菌丝型，其发酵液抑菌率最高达到61.30±0.54％。盆栽实验：接种15-30d处理组棉花黄萎病病指差异较大。不含共生菌的大丽轮枝菌发酵液施加到棉苗中，病情指数为69.75，接种B.olei30d棉苗与其他处理组相比无发病症状，病指统计结果为0，即B.olei无致病力。由温室盆栽实验结果可知，B.olei对棉花黄萎病的致病性有较好抑制作用。电镜观察：随培养时间及发酵液浓度增加大丽轮枝菌分生孢子形成减少，菌丝形态发生膨胀、破裂、异型，微菌核逐渐减少消失。大丽轮枝菌微菌核减少或不产生都会降低其致病力，黄萎病害相应减轻，该研究证明共生B.olei对大丽轮枝菌有较好抑菌活性。附图说明图1A真菌引物鉴定4株黄萎病菌4株黄萎病菌PCR扩增结果；(Mmarker2KPlusII；lane1空白对照；lane210-4；lane336928；lane429-16；lane5JZ708)；图1B细菌引物鉴定4株黄萎病菌4株黄萎病菌PCR扩增结果；(Mmarker2KPlusII；lane1空白对照；lane210-4；lane336928；lane429-16；lane5JZ708；lane6阳性对照)；图2棉花黄萎病菌株物种组成及丰度分析(A10-4；B29-16；C36928；DJZ708)；图3共生菌形态学鉴定(A共生菌菌落形态；B光学显微镜；C扫描电镜；D革兰染色)；图4基于16SrDNA基因序列构建的4株内生菌与其相邻菌株的neighbour-joining系统进化树；图5共生菌与大丽轮枝菌摇瓶共培养；(50％、20％和10％稀释后的内共生菌菌液加入Czapek液体培养基中分别培养5天、10天和15天大丽轮枝菌生长状态，其中对照CK为不加B.olei菌液)；图6共生菌与大丽轮枝菌共培养菌落形态；50％、20％和10％稀释后的内共生菌菌液接种到棉花黄萎病菌菌饼后观察大丽轮枝菌形态图，A为5天观察时的固体平板的正反面照片；B为10天观察时的固体平板的正反面照片；C为15天观察时的固体平板的正反面照片；D为抑菌圈面积统计图)；图7扫描电镜观察B.oleid对大丽轮枝菌形态影响(A为B.olei菌液共培养电镜图，B为B.olei无菌发酵液共培养电镜图)；图8盆栽实验棉株生长情况，(A.V.dahliae36928、B.symbiont-free36928抗生素除去共生菌、C.V.dahliae36928+symbiont-free36928、D.B.olei、E.无菌水空白对照)。具体实施方式实施例1：黄萎病原菌分子生物学鉴定黄萎病原菌DNA的提取：取黄萎病菌丝，液氮速冻破壁，研磨成粉，转移到1.5mL离心管中；加入700μL预热到65℃的CTAB缓冲液，65℃水浴50min，其间每隔10min将离心管上下颠倒，使菌丝粉末和缓冲液充分混匀；离心机提前预冷至4℃，12000rpm离心15min；取出离心管将上清液转移到新的离心管中，加入DNA抽提液Ⅰ600μL，混合均匀后12000rpm离心15min；吸取上清液转移到新的离心管中，重复上述步骤；将上清液转移到新的离心管中，加入DNA抽提液Ⅱ600μL，混合均匀后，12000rpm离心15min；取出离心管，吸取上清液到新的离心管中，加入预冷的异丙醇600μL，混合均匀后放置于-20℃冰箱中静置30min；取出离心管，12000rpm离心15min；去掉上清液，离心管中加入600μL70％的乙醇溶液将沉淀洗涤两次；在无菌风中将沉淀吹干，加入30～50μL的ddH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大丽轮枝菌内共生菌短波单胞菌，其特征在于，命名为大丽轮枝菌内共生菌短波单胞菌(Brevundimonas olei dahliae olei)，其保藏号为CCTCC NO：M 2020392。/n

【技术特征摘要】
1.一种大丽轮枝菌内共生菌短波单胞菌，其特征在于，命名为大丽轮枝菌内共生菌短波单胞菌(Brevundimonasoleidahliaeolei)，其保藏号为CCTCCNO：M2020392。


2.一种微生物制剂，其特征在于，含权利要求1所述的短波单胞菌(Brevundimonasoleidahliaeolei)的无菌培养液。


3.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，将短波单胞菌(Brevundimonasoleidahliaeolei)接种于LB培养基中，37℃，180r·min-1，培养16-24h，6000r·min-1离心10min，取上...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾红，高畅，华羚淇，刘桂敏，
申请(专利权)人：塔里木大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65