一种具有良好抑菌能力的解淀粉芽孢杆菌制造技术

一种具有良好抑菌能力的解淀粉芽孢杆菌，通过对解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TXM‑2，保藏编号为CGMCC No.19549，进行ARTP诱变，获得诱变株AR7，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏编号为CGMCC No.20623，保藏日期为2020年09月09日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该诱变株的遗传稳定性良好，最大活菌数为1.65×10

【技术实现步骤摘要】
一种具有良好抑菌能力的解淀粉芽孢杆菌
本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种具有良好抑菌能力的解淀粉芽孢杆菌。
技术介绍
镰刀菌是一类全球广泛分布的真菌，可导致作物的枯萎病、根腐病等多种病害。致病性的镰刀菌菌株寄主达100多种，许多镰刀菌菌株能在种植或收获后感染多数农作物及观赏植物，如F.oxysporumf.sp.Lycopersici会导致番茄血管枯萎病，F.oxysporumf.sp.Cubense会导致香蕉枯萎病，极大的降低了作物的产量和品质，是生产上较难防治的重要病害之一，目前尚无有效的治疗和控制方法，因此，寻找绿色、健康、高效的生物防治手段成为当务之急。常压室温等离子体(ARTP)是近年来提出的一种新的大气压辉光放电冷等离子体源，能在大气压下产生温度在25～40℃之间具有高活性粒子浓度的等离子体射流，包括处于激发态的氦、氮原子，以及羟基自由基等，能量以辐射的方式传递到生物体内后，生物体内各分子便产生电离与激发，产生了多种化学性质活泼的自由原子或基团，通过彼此间的相互反应，并与大分子核酸和蛋白质反应，引起分子结构发生改变，影响如DNA合成的中止、酶活性改变等生化过程，使得染色体等各部分结构进一步变化。区别于传统诱变方法，ARTP具有安全稳定、使用方便、突变速度快等多种优点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有良好抑菌能力的解淀粉芽孢杆菌，通过对保藏编号为CGMCCNo.19549的解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)TXM-2进行ARTP诱变，获得诱变株AR7，其具有良好的抑菌能力，对镰刀菌、玉米茎腐病病原菌、交链孢霉等有较好的拮抗作用，抑制率为70％以上，经传代培养，该诱变株的遗传稳定性良好，活菌数高。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：一种具有良好抑菌能力的解淀粉芽孢杆菌，其为AR7，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，保藏编号为CGMCCNo.20623，保藏日期为2020年09月09日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本专利技术所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)AR7，其对尖孢镰刀菌的抑菌直径为3.0-3.5cm，OD600为5.5-5.8，最大活菌数为1.65×109-2.0×109cfu/mL。进一步，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)AR7的发酵培养基中包括：葡萄糖0.5-1.5％，酵母浸粉2.0-2.5％，NaCl0.5-1.5％。本专利技术所述具有良好抑菌能力的解淀粉芽孢杆菌的选育方法，包括如下步骤：1)制备菌悬液将活化后的解淀粉芽胞杆菌TXM-2接种至LB培养基中，于37℃、180r/min摇瓶培养至对数生长期，稀释菌体浓度至107cfu/mL，取稀释后的菌体于4000r/min、4℃条件下离心处理10min，将离心后的沉淀物用无菌生理盐水悬浮，得到菌悬液；2)ARTP诱变处理将上述菌悬液与10vol％甘油按体积比1：1的比例混合，混合后均匀涂在ARTP诱变仪的载片上，置于凹槽内，并在凹槽下放入装有无菌生理盐水的离心管，设置诱变时间，再进行ARTP诱变；ARTP功率120W，通气量10L/min，冷却循环控制温度为20℃，设置不同诱变时间的待处理样品进行诱变，诱变时间依次设为2s、4s、6s、8s、10s、12s、14s、16s、18s和20s，处理结束后，将落有载片的离心管取出，置于震荡机低速洗脱1min；分别计算不同诱变时间下样品的诱变致死率，以未诱变处理的菌体作为对照，根据致死率(％)确定最终的诱变条件；3)初筛变异菌株分别将上述不同诱变时间浓度为108cfu/mL的诱变株种子液按1％的接种量转接于装有Landy培养基中，于37℃、180r/min摇瓶培养48h，取发酵液，于4℃、12000r/min离心20min后经0.22μm滤膜过滤，再将无菌发酵上清与冷却至55℃的PDA培养基充分混合，使发酵上清的含量为100.0μL/mL；然后以同体积无菌水为对照，将平板中央接种培养5～6d的禾谷镰孢菌菌落边缘菌饼(Φ＝7mm)，每处理重复3次，置于30℃恒温培养箱中培养4～5d，观察和测量病原菌的菌落直径，并按照下式分别计算抑菌率；纯生长量＝菌落的平均直径-菌饼直径筛选出抑菌率70％以上的突变株；4)传代培养将初筛后所获得的菌株分别使用平板划线连续培养传至5代，并测量每一代的病原菌直径，选出病原菌直径与出发菌株处理下的病原菌直径基本一致的菌株，获得解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)AR7。本专利技术筛选获得的解淀粉芽孢杆菌AR7的最佳培养基为：葡萄糖0.5-1.5％，酵母浸粉1.5-2.5％，NaCl0.5-1.0％。本专利技术提供所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)AR7在生物防治剂中的应用。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术利用ARTP技术对解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)TXM-2进行诱变，以禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)为指示菌，筛选出拮抗效果提升的解淀粉芽胞杆菌AR7，与出发菌株解淀粉芽胞杆菌TXM-2相比，解淀粉芽胞杆菌AR7对镰刀菌、玉米茎腐病病原菌、交链孢霉的抑菌率提升30％以上。本专利技术的解淀粉芽胞杆菌AR7，经传代培养，该诱变株的遗传稳定性良好，最大活菌数可达到1.65×109-2.0×109cfu/mL，对镰刀菌、玉米茎腐病病原菌、交链孢霉等有较好的拮抗作用，抑制率为70％以上；对尖孢镰刀菌的抑菌直径为3.0-3.5cm，OD600为5.5-5.8，其对禾谷镰孢菌的抑制率达72％以上，较解淀粉芽胞杆菌TXM-2明显增加。本专利技术以菌浓和对尖刀镰孢菌的抑菌直径为指标，分别采用单因素试验和正交试验优化培养基配方及其浓度，确定了适于菌株培养基的最佳无机盐、氮源及碳源。附图说明图1为本专利技术实施例1中经ARTP处理后TXM-2的致死率曲线。图2为本专利技术实施例1中解淀粉芽胞杆菌对禾谷镰孢菌的拮抗作用。图3为本专利技术实施例1中诱变株连续培养5代病原菌的直径。图4为本专利技术实施例1中不同培养基对诱变株AR7抑菌直径和OD600的影响。图5为本专利技术实施例2中不同无机盐对诱变株AR7在抑菌直径和OD600的影响。图6为本专利技术实施例2中不同氮源对诱变株AR7抑菌直径和OD600的影响。图7为本专利技术实施例2中不同碳源对诱变株AR7抑菌直径和OD600的影响。图8为本专利技术实施例2中诱变株AR7与玉米茎腐病病原菌的对峙平板图。图9为本专利技术实施例2中诱变株AR7与尖孢镰刀菌的对峙平板图。图10为本专利技术实施例2中诱变株AR7与交链本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有良好抑菌能力的解淀粉芽孢杆菌，其为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)AR7，保藏编号为CGMCC No.20623，保藏日期为2020年09月09日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有良好抑菌能力的解淀粉芽孢杆菌，其为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)AR7，保藏编号为CGMCCNo.20623，保藏日期为2020年09月09日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。


2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌对镰刀菌、玉米茎腐病病原菌或交链孢霉的抑制率为70％以上。


3.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄艳娜，唐雪明，束仕元，王赛赛，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31