用于逆转细胞老化的瞬时细胞重编程制造技术

本文提供了可用于细胞更生、组织工程化和再生医学的方法和组合物。公开了用于使老化的细胞和组织更生以恢复功能性的组合物和方法。确切地说，通过瞬时暴露于编码重编程因子的非整合型mRNA而使细胞更生，同时使得细胞保持在分化的状态。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于逆转细胞老化的瞬时细胞重编程相关申请的交叉引用本申请要求于2018年3月13日提交的第62/642538号美国临时专利申请的优先权，该临时专利申请通过引用以其整体并出于所有目的并入本文。关于在联邦政府资助的研究和开发下的公开的权利声明此公开是以授权号R01AR070865和R01AR070864(美国国立卫生研究院(NIH/NIAMS))、授权号P01AG036695、R01AG23806(R37MERIT奖)、R01AG057433和R01AG047820(美国国立卫生研究院(NIH))、美国退伍军人事务部(BLR&D和RR&D成果审评)以及CalPoly资助奖#TB1-01175，在政府支持下开发的。政府拥有本公开的一定权益。
技术介绍
老化的特征在于分子、细胞、组织和生物体水平上逐渐发生的功能丧失。在染色质水平上，老化与表观遗传错误的逐步积累相关，所述表观遗传错误最终导致异常基因调节、干细胞衰竭、衰老以及细胞/组织稳态失调。通过少量转录因子的过表达将核重编程成为多能性的技术，可以通过驱动表观遗传重编程将任何细胞的年龄和身份恢复为胚胎细胞的年龄和身份。由于对细胞身份的不良擦除所产生的对组织和器官的结构、功能和细胞类型分布的破坏，因此对细胞身份的不良擦除对于更生(rejuvenative)疗法的开发是有问题的。专利技术简述鉴于前述内容，需要一种避免去分化和细胞身份(cellidentity)丧失的使细胞更生(rejuvenatingcells)的改进方法。本公开解决了该需求，并且还提供了额外的益处。本公开总体上涉及细胞更生、组织工程化和再生医学。确切地说，本公开涉及通过瞬时暴露于编码重编程因子的非整合型(non-integrated)mRNA中而使老化细胞和组织更生以恢复功能性的组合物和方法，所述重编程因子使细胞更生，同时使得细胞保持在已分化状态。本公开涉及利用更生的细胞的基于细胞的疗法。确切地说，本公开涉及通过瞬时暴露于编码重编程因子的非整合型mRNA中而使老化细胞和组织更生以恢复功能性的方法，所述重编程因子使细胞更生，同时使得细胞保持在已分化状态。在一个方面中，本文提供了使细胞更生的方法，所述方法包括用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使RNA来转染细胞不超过五(5)个连续日，从而产生更生的细胞。在一个方面中，本文提供了用于治疗对象的与年龄相关的疾病或病况、软骨变性病症、神经变性病症和/或肌肉骨骼功能障碍的方法。所述方法包括施用治疗有效量的细胞，所述细胞包括编码了一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使RNA。在一个方面中，本文提供了用于治疗对象的与年龄相关的疾病或病况、软骨变性病症、神经变性病症和/或患有肌肉骨骼功能障碍的对象的方法。所述方法包括施用治疗有效量的编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使RNA。在一个方面中，本文提供离体使工程化的组织更生的方法。所述方法包括用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使RNA来转染所述组织不超过五(5)个连续日，从而产生更生的工程化组织。在一个方面中，本文提供了一种药物组合物，包括通过用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使RNA来转染细胞不超过五(5)个连续日而获得的更生的细胞。因此，在一个方面中，本公开包括一种使细胞更生的方法，所述方法包括：a)用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使RNA来转染细胞，其中所述转染以每天一次执行至少两天且不超过4天；以及b)翻译一种或多种非整合型信使RNA，以在细胞中产生一种或多种细胞重编程因子，导致细胞的瞬时重编程，其中所述细胞被更生而没有去分化为干细胞。所述方法可以在体外、离体或体内对细胞进行。在某些实施方案中，用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使RNA的转染以每天一次进行2天、3天或4天。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞重编程因子选自由OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、LIN28和NANOG组成的组。在一个实施方案中，所述一种或多种细胞重编程因子包括OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、LIN28和NANOG。所述方法可以对任何类型的细胞进行。在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞(例如人、非人灵长类、啮齿动物、猫、狗、牛、马、猪、山羊等)。例如，所述方法可以在成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞或骨骼肌干细胞上进行。在另一个实施方案中，所述细胞来自老年对象。在某些实施方案中，所述瞬时重编程致使HP1γ、H3K9me3、层支持蛋白(laminasupportprotein)LAP2α和SIRT1的表达增加，GMSCF、IL18和TNFα的表达减少，核折叠减少，出泡减少，细胞自噬体形成增加，糜蛋白酶样蛋白酶体活性升高，线粒体膜电位提高或反应性氧簇(ROS)减少。在某些实施方案中，所述细胞在组织或器官内。根据本文所述的方法，瞬时重编程可以恢复组织或器官中的细胞的功能、提高组织或器官中的细胞的潜能(potency)、减少组织或器官内的衰老细胞的数量、增强组织或器官内的细胞的复制能力，或延长组织或器官内细胞的寿命。在另一个方面中，本公开包括一种治疗对象的与年龄相关的疾病或病况的方法，所述方法包括：a)用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使RNA来转染所述对象的细胞，其中所述转染以每天一次进行至少两天且不超过4天；以及b)在所述对象中的细胞中表达所述一种或多种细胞重编程因子，导致所述细胞的瞬时重编程，其中所述细胞被更生而没有去分化为干细胞。所述细胞可以离体或在体内被转染。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞重编程因子选自由OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、LIN28和NANOG组成的组。在一个实施方案中，所述一种或多种细胞重编程因子包括OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、LIN28和NANOG。在某些实施方案中，所述与年龄有关的疾病或病况是变性疾病、神经变性疾病、心血管疾病、外周血管疾病、皮肤疾病、眼部疾病、自身免疫疾病、内分泌失调、代谢失调、肌肉骨胳病症、消化系统疾病或呼吸系统疾病。在另一个实施方案中，本公开包括一种治疗对象的涉及软骨变性的疾病或病况的方法，所述方法包括：a)用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使RNA来转染所述对象的软骨细胞，其中所述转染以每天一次进行至少两天且不超过4天；以及b)在所述软骨细胞中表达所述一种或多种细胞重编程因子，导致所述软骨细胞的瞬时重编程，其中所述软骨细胞被更生而没有去分化为干细胞。更生的软骨细胞可以被移植到例如对象的关节炎关节中。所述方法可以离体、在体外或体内进行。在一个实施方案中，软骨细胞从得自对象的软骨样品中被分离，并被离体转染，然后被移植到对象中。在某些实施方案中，涉及软骨变性的疾病或病况是关节炎(例如，骨关节炎或类风湿性关节炎)。在某些实施方案中，治疗减轻对象中的炎症。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使细胞更生的方法，所述方法包括用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使RNA来转染细胞不超过五(5)个连续日，从而产生更生的细胞。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180313 US 62/642,5381.一种使细胞更生的方法，所述方法包括用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使RNA来转染细胞不超过五(5)个连续日，从而产生更生的细胞。


2.权利要求1的方法，其中所述更生的细胞的转录组谱变得与年轻细胞的转录组谱更相似。


3.权利要求2的方法，其中所述更生的细胞的所述转录组谱包括选自RPL37、RHOA、SRSF3、EPHB4、ARHGAP18、RPL31、FKBP2、MAP1LC3B2、Elf1、Phf8、Pol2s2、Taf1和Sin3a的一种或多种基因的基因表达增加。


4.权利要求1的方法，其中与参考值相比，所述更生的细胞呈现出一种或多种核和/或表观遗传标志物的基因表达增加。


5.权利要求4的方法，其中所述标志物选自HP1γ、H3K9me3、层支持蛋白LAP2α和SIRT1蛋白。


6.权利要求1的方法，其中与参考值相比，所述更生的细胞呈现出蛋白水解活性增加。


7.权利要求6的方法，其中所述蛋白水解活性增加被测量为细胞自噬体形成增加、糜蛋白酶样蛋白酶体活性增加或其组合。


8.权利要求1的方法，其中与参考值相比，所述更生的细胞呈现出改善的线粒体健康和功能。


9.权利要求8的方法，其中改善的线粒体健康和功能被测量为线粒体膜电位升高、活性氧簇(ROS)减少或其组合。


10.权利要求1的方法，其中与参考值相比，所述更生的细胞呈现出一种或多种SASP细胞因子的表达降低。


11.权利要求10的方法，其中所述SASP细胞因子包括IL18、IL1A、GROA、IL22和IL9中的一种或多种。


12.权利要求1的方法，其中所述更生的细胞呈现出甲基化谱的逆转。


13.权利要求12的方法，其中所述甲基化谱的逆转通过Horvath钟估计来测量。


14.权利要求4的方法，其中所述参考值是从老化的细胞获得的。


15.权利要求1的方法，其中用信使RNA转染所述细胞包括选自以下的方法：lipofectamine和LT-1介导的转染、右旋糖酐介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、电穿孔、mRNA在脂质体中的包封和直接显微注射。


16.权利要求1的方法，其中所述一种或多种细胞重编程因子选自OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、LIN28和NANOG。


17.权利要求1的方法，其中所述一种或多种细胞重编程因子包括OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、LIN28和NANOG。


18.权利要求1的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。


19.权利要求18的方法，其中所述细胞是人类细胞。


20.权利要求19的方法，其中所述细胞来自老年对象。


21.权利要求18的方法，其中所述细胞选自成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞、骨骼肌干细胞、角质化细胞、间充质干细胞和角膜上皮细胞。


22.权利要求21的方法，其中所述细胞是间充质干细胞。


23.权利要求22的方法，其中更生的间充质干细胞呈现出衰老参数(p16、p21和阳性SAβGal染色)的降低，细胞增殖增加和/或ROS水平降低。


24.权利要求1的方法，其中所述方法在体外、离体或体内进行。


25.权利要求24的方法，其中所述方法在体内进行。


26.权利要求25的方法，其中所述细胞在组织或器官内。


27.权利要求26的方法，其中所述方法减少所述组织或器官内的衰老细胞的数量。


28.权利要求27的方法，其中所述方法降低IL18、IL1A、GROA、IL22和IL9中的一种或多种的表达。


29.权利要求1的方法，其中所述方法恢复所述细胞的功能、增加所述细胞的潜能、增强所述细胞的存活能力或增加所述细胞的复制能力或寿命，或其组合。


30.权利要求1的方法，其中所述转染以每天一次进行5天。


31.权利要求1的方法，其中所述转染以每天一次进行4天。


32.权利要求1的方法，其中所述转染以每天一次进行3天。


33.权利要求1的方法，其中所述转染以每天一次进行2天。


34.一种用于治疗对象的与年龄相关的疾病或病况、软骨变性病症、神经变性病症和/或肌肉骨骼功能障碍的方法，所述方法包括施用治疗有效量的细胞，其中所述细胞包括编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使RNA。


35.权利要求34的方法，其中所述一种或多种细胞重编程因子选自OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、LIN28和NANOG。


36.权利要求35的方法，其中所述一种或多种细胞重编程因子包括OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、L...

【专利技术属性】
技术研发人员：V·塞巴斯蒂亚诺，T·J·萨尔卡，
申请(专利权)人：利兰斯坦福初级大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US