一种C1orf70小体的制备及分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种C1orf70小体的制备及分离纯化方法。本发明专利技术人发现在真核生物细胞中过表达外源性C1orf70基因，C1orf70在细胞(如293Ta)中会组装成C1orf70小体。通过体外扩增含有C1orf70小体的293Ta细胞，C1orf70小体可以大量获得，并且通过研磨破碎细胞，差速离心分离细胞组分，滤膜过滤的方法，可以对C1orf70小体进行分离、纯化。本发明专利技术的提出对于研究C1orf70小体的内部结构，及其组装机制，并进一步了解C1orf70在SCA21疾病中的相关作用方式具有重要意义，具有潜在的临床应用价值。同时对于以SCA21疾病为代表的跨膜蛋白异常疾病也具有重要的参考意义。

【技术实现步骤摘要】
一种C1orf70小体的制备及分离纯化方法
本专利技术涉及一种C1orf70小体的制备及分离纯化方法。本专利技术属于生物工程

技术介绍
第1号染色体开放读码框70(Chromosome1OpenReadingFrame70，C1orf70)也称作跨膜蛋白C1orf70(TransmembraneProteinC1orf70)，脊髓小脑共济失调21(SpinocerebellarAtaxia21，SCA21)或跨膜蛋白240(TransmembraneProtein240，TMEM240)。C1orf70是在中枢神经系统中发现的编码含有两个跨膜结构域蛋白质的基因，人类C1orf70基因位于1号染色体短臂36.33处，基因序列长1128bp，可编码区长522bp，编码由173个氨基酸组成的蛋白质，其分子量约为20KD[J.Delplanque,D.Devos,V.Huin,A.Genet,O.Sand,C.Moreau,C.Goizet,P.Charles,M.Anheim,M.L.Monin,L.Buee,A.Destee,G.Grol本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种C1orf70小体的制备及分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)在293Ta细胞中过表达C1orf70基因，使293Ta细胞带有C1orf70小体；/n(2)对C1orf70过表达的293Ta进行抗生素筛选，并获得稳定克隆，得到纯化的C1orf70过表达的293Ta细胞系；/n(3)用细胞刮刀收集C1orf70过表达的293Ta细胞；/n(4)用玻璃研磨器对C1orf70过表达的293Ta细胞进行细胞破碎；/n(5)通过吹打使C1orf70小体与细胞其它组分分开；/n(6)通过低速离心使C1orf70小体与细胞核、细胞碎片以及其它大块组织分离；/n(7)通过中速离心使C1o...

【技术特征摘要】
1.一种C1orf70小体的制备及分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在293Ta细胞中过表达C1orf70基因，使293Ta细胞带有C1orf70小体；
(2)对C1orf70过表达的293Ta进行抗生素筛选，并获得稳定克隆，得到纯化的C1orf70过表达的293Ta细胞系；
(3)用细胞刮刀收集C1orf70过表达的293Ta细胞；
(4)用玻璃研磨器对C1orf70过表达的293Ta细胞进行细胞破碎；
(5)通过吹打使C1orf70小体与细胞其它组分分开；
(6)通过低速离心使C1orf70小体与细胞核、细胞碎片以及其它大块组织分离；
(7)通过中速离心使C1orf70小体与比重轻的细胞器分离；
(8)通过滤膜过滤进一步纯化C1orf70小体；
(9)高速离心获得纯化的C1orf70小体。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的在293Ta细胞中过表达C1orf70基因，使293Ta细胞带有C1orf70小体通过以下步骤实现：
设计用于扩增C1orf70基因的引物，以人神经组织cDNA为模板为PCR模板，对人源C1orf70基因进行扩增，所述的引物序列如下所示：
上游引物hC1orf70-F：AAACTCGAGACCATGTCCATGAGTGCGAAC
下游引物hC1orf70-R：AAAGCGGCCGCTTACAGGTGCCGCGGGCTG
对PCR产物和质粒载体pLVX-AcGFP-N1分别进行XhoI和NotI酶切，用T4连接酶将经过XhoI和NotI酶切后的PCR产物连接入酶切后的pLVX-AcGFP-N1骨架载体中，获得pLVX-C1orf70-ΔAcGFP-N1质粒，其中所含有的C1orf70的基因序列如SEQIDNO.1所示；
用脂质体将质粒pLVX-C1orf70-ΔAcGFP-N1和包装质粒psPAX2，pMD2.G共同转入293Ta细胞中，使293Ta细胞生成带有C1orf70基因的慢病毒颗粒；
其中，优选的，质粒pLVX-C1orf70-ΔAcGFP-N1和包装质粒psPAX2，pMD2.G的摩尔比为1：1：1。...

【专利技术属性】
技术研发人员：王菁华，穆莉莉，王广友，孔庆飞，赵崴，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23