黄曲霉毒素M1半抗原与全抗原制备及其快速转移定量试剂盒制备与应用制造技术

本发明专利技术公开了黄曲霉毒素M1半抗原与全抗原制备及其快速转移定量试剂盒制备与应用。本发明专利技术提供的黄曲霉毒素M1半抗原与载体蛋白连接可以得到黄曲霉毒素M1抗原。所述黄曲霉毒素M1抗原可应用于制备黄曲霉毒素M1特异性抗体。本发明专利技术制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高。本发明专利技术的黄曲霉毒素M1全抗原，黄曲霉毒素M1特异性抗体，可用于制备检测黄曲霉毒素M1残留的化学发光酶联免疫检测试剂盒，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高、特异性强等诸多优点。

【技术实现步骤摘要】
黄曲霉毒素M1半抗原与全抗原制备及其快速转移定量试剂盒制备与应用
本专利技术涉及一种半抗原、抗原及其制备方法，具体涉及黄曲霉毒素M1半抗原与全抗原制备及其快速转移定量试剂盒制备与应用。
技术介绍
黄曲霉毒素M1(AflatoxinM1，缩写AFM1),其基本结构为一个二呋喃环的氧杂萘邻酮。分子式为C17H12O7，形状为长方形片状，无色结晶。物理化学性质相当稳定，不被巴氏消毒破坏。AFM1属于黄曲霉毒素(Aflatoxins)一类结构相似的化合物中的一种,该类毒素是由常见的黄曲霉菌(AsperillusFlavus)和寄生曲霉菌(AsperillusParasiticus)产生的代谢产物，其中黄曲霉毒素B1是最主要的一种毒素，哺乳类动物摄入被AFB1污染的饲料或食品后，在体内的肝微粒体单氧化酶系催化下，通过细胞色素P-448调节作用，AFB1末端呋喃环C-10被羟化而生成AFM1。AFM1也可由一些黄曲霉菌和寄生曲霉直接产生，其毒性仅次于黄曲霉毒素B1。研究表明，黄曲霉毒素M1为强致癌剂，WHO将其列为Ⅰ类致癌物,是世界各国的重点监控对象。黄曲霉毒素M1进入人或动物体内后，除抑制DNA、RNA合成外，也抑制肝脏蛋白质合成，导致人体中毒。其危害主要表现在3个方面：损害组织器官；致癌、致畸、致突变，引发动物及人类的肝癌、肾癌和胃癌等；抑制免疫机能。其毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，主要危害的部位在肝脏。世界卫生组织制定食品黄曲霉毒素最高允许浓度为15μg/kg，美国联邦政府有关法律规定人类消费的牛奶中的含量不能超过0.5μg/kg，其他动物饲料中的含量不能超过300μg/kg。我国今年发布的《GB2761-2011食品中真菌毒素限量》国家标准中规定食品中黄曲霉毒素M1在乳及乳制品中的限量为0.5μg/kg。而欧盟国家规定更加严格，原奶、热处理奶及加工奶产品中M1限量为0.05μg/kg，婴儿食品(包括婴幼儿奶)中M1限量为0.025μg/kg。因此，建立特异、敏感的黄曲霉毒素M1的检测方法是当务之急。在黄曲霉毒素M1的检测方法方面，目前最为常用的方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、酶联免疫吸附分析法(enzyme1inkedimmunosorbentassay,ELISA)、免疫亲和柱法等方法。HPLC法具有检测精确度高、假阳性率低的优点，主要缺点是仪器价格昂贵、操作比较繁琐，耗时长，检测费用昂贵，操作技术要求高；且前期样本的萃取条件的选择也对检测灵敏度和准确性有较大影响。TLC法的特异性较差，灵敏度也相对较差，所需标准品浓度较高，潜在的污染性较高。免疫亲和柱特异性较好，但需结合HPLC仪和荧光光度计才能定量检测，检测技术要求和成本较高。酶联免疫吸附分析法是当前应用最广、发展最快的免疫酶技术之一，主要优点在于检测迅速，样本前处理简单，检测系统操作简单，污染较小、灵敏度也较高，成本低，同时便于进行大规模检测，符合目前国际上检测领域的发展方向。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了黄曲霉毒素M1半抗原与全抗原制备及其快速转移定量试剂盒制备与应用。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案为：本专利技术提供的黄曲霉毒素M1半抗原，为式1所示的化合物。式1本专利技术还公开了式1所示化合物的制备方法，包括如下步骤：①用万分之一电子天平称取4.6mg黄曲霉毒素M1和8mg羧基甲氧基胺盐酸盐溶于8mL吡啶中，加入回流瓶中，控温80-90℃回流16小时；②将所得溶液用旋转蒸发仪旋转蒸干后，用0.1mol/L氢氧化钾调节PH值到9.0左右，立即加入10mL乙酸乙酯混合均匀，静止分层；③去掉下层水相，取上层有机相乙酸乙酯用旋转蒸发仪吹干，得到浅黄色固体油状物，经过鉴定为黄曲霉毒素M1半抗原。本专利技术提供的黄曲霉毒素M1抗原，是将式1所示化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物。常用载体蛋白均可采用，如牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白（HSA），鼠血清白蛋白（MSA），甲状腺蛋白（TG）或血蓝蛋白（KLH）等。所述式1所示化合物与BSA偶联得到的AFM1抗原的结构示意图见图1。本专利技术还公开了所述AFM1全抗原的制备方法，包括如下步骤：①用精密电子天平称取30mgBSA溶解于10ml浓度为0.1MOL/L碳酸盐缓冲液中，做为A液；②再将以上半抗原用2毫升N，N-二甲基甲酰胺溶解后，加入20mgDCC、20mgNHS作为B液；③活化30分钟后，将B液缓慢滴加到A液中，室温搅拌16小时后，选择0.01MOL/LPBS缓冲液透析7个工作日，放置2-8℃冰箱，每天换液3次，透析后，离心去掉下层沉淀，取上清分装保存。所述黄曲霉毒素M1抗原可以作为免疫原制备黄曲霉毒素M1特异性抗体，也可以作为包被原制备微孔板。应用黄曲霉毒素M1抗原制备得到的特异性抗体具体可为单克隆抗体或多克隆抗体。本专利技术还公开了所述AFM1多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：取黄曲霉毒素M1全抗原作为免疫原溶液，用pH7.2、0.02M的PBS缓冲液稀释，得到免疫原稀释液，用于黄曲霉毒素M1多克隆抗体的制备，采用西南地区江口县梵净山养殖的黑山羊作为黄曲霉毒素M1多克隆抗体免疫动物，免疫步骤如下：①初次免疫：将黄曲霉毒素M1免疫原稀释液与等体积的北京测尔康生物技术有限公司制备的完全佐剂混合制成乳化剂，采用颈背部皮下多点注射，免疫剂量一次为5000ug/只；②加强免疫：初次免疫30天后、60天后和90天后，各进行一次加强免疫，将黄曲霉毒素M1免疫原稀释液与等体积的北京测尔康生物技术有限公司制备的不完全佐剂混合乳化，不同部位，颈背部皮下多点注射，单次免疫剂量为5000ug/只；③末次免疫：首次免疫120天后进行末次免疫，直接颈背部皮下多点注射黄曲霉毒素M1免疫原稀释液，免疫剂量为5000ug/只；末次免疫14天后，采血并分离血清，即为免疫原对应的曲霉毒素M1多克隆抗体，可以应用试剂盒的制备。所述黄曲霉毒素M1抗原、所述特异性抗体均可应用于检测黄曲霉毒素M1药物残留。本专利技术公开了应用黄曲霉毒素M1抗原和黄曲霉毒素M1特异性抗体制备得到的快速转移定量试剂盒。所述快速转移定量试剂盒，包括：黄曲霉毒素M1标准品工作液、黄曲霉毒素M1高浓度标准品、黄曲霉毒素M1酶标板、黄曲霉毒素M1酶标记物浓缩液、浓缩洗涤液、底物液、终止液。本专利技术依靠免疫学、免疫化学基本原理和残留分析技术手段，设计、合成小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物的特异性抗体。利用抗原抗体的特异性免疫学反应，定量的检测样品中微量小分子目标分析物。本专利技术制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高。本专利技术克服了现有检测技术中对黄曲霉毒素M1样品预处理复杂、耗时、且需要大量有机溶剂萃取，以及在检测过程中要用到精密昂贵的检测仪器而不适于推广使用等缺点。本专利技术的黄曲霉毒素M1抗原，通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黄曲霉毒素M1半抗原，为式 1 所示化合物 ：/n

【技术特征摘要】
1.一种黄曲霉毒素M1半抗原，为式1所示化合物：

式1。


2.式1所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
①用万分之一电子天平称取4.6mg黄曲霉毒素M1和8mg羧基甲氧基胺盐酸盐溶于8mL吡啶中，加入回流瓶中，控温80-90℃回流16小时；
②将所得溶液用旋转蒸发仪旋转蒸干后，用0.1mol/L氢氧化钾调节PH值到9.0左右，立即加入10mL乙酸乙酯混合均匀，静止分层；
③去掉下层水相，取上层有机相乙酸乙酯用旋转蒸发仪吹干，得到浅黄色固体油状物，经过鉴定为黄曲霉毒素M1半抗原。


3.一种黄曲毒霉M1全抗原为式2，是将式1所示化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物。


4.式2.
根据权利要求3所述黄曲毒霉M1全抗原，其特征在于，所述牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白（HSA），鼠血清白蛋白（MSA），甲状腺蛋白（TG）或血蓝蛋白（KLH）。


5.权利要求3或4所述的黄曲毒霉M1全抗原的制备方法，包括如下步骤：
①用精密电子天平称取30mgBSA溶解于10毫升浓度为0.1MOL/L碳酸盐缓冲液中，做为A液；
②再将以上半抗原用2毫升N，N-二甲基甲酰胺溶解后，加入20mgDCC、20mgNHS作为B液；
③活化30分钟后，将B液缓慢滴加到A液中，室温搅拌16小时后，选择0.01MOL/LPBS缓冲液透析7个工作日，放置2-8℃冰箱，每天换液3次，透析后，离心去掉下层沉淀，取上清分装保存；
所述黄曲霉毒素M1抗原可以作为免疫原制备黄曲霉毒素M1特异性抗体，也可以作为包被原制备微孔板。


6.权利要求3或4所述黄曲霉毒素M1抗原在制备黄曲...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴小平，
申请(专利权)人：北京测尔康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11