肿瘤特异性T细胞的检测方法技术

本发明专利技术公开了肿瘤特异性T细胞的检测方法，收集肿瘤细胞或者肿瘤组织的全细胞组分后，采用游离全细胞组分或者将全细胞裂解物组分负载于纳米/微米粒子后与外周免疫细胞共孵育，在癌症特异性T细胞被激活后检测肿瘤特异性T细胞的特异性分子即可确定外周血等外周组织中癌症特异性T细胞的含量。本发明专利技术全细胞裂解物组分为水溶性成分和非水溶性成分，为游离状态或者负载于纳米粒子或微米粒子，负载方式为全细胞的水溶性成分和非水溶性成分分别或同时被包载于粒子内部，和/或分别或同时负载于粒子表面；检测方法为流式细胞术、酶联免疫斑点技术、酶联免疫吸附技术、胶体金免疫层析法、基因检测技术等。

【技术实现步骤摘要】
肿瘤特异性T细胞的检测方法
本专利技术属于免疫治疗和免疫检测领域，具体涉及一种基于全细胞的肿瘤特异性T细胞的检测方法。
技术介绍
近些年来免疫技术的发展极其迅速，尤其是癌症的免疫治疗领域。随着对癌症认识的不断提高，人们发现人体的免疫系统和各类免疫细胞在抑制癌症发生、发展的过程中扮演着关键角色。最近几年PD-1抗体和CAR-T等疗法相继获批进入临床，其临床效果良好，但是癌症疫苗和PD-1抗体等癌症免疫治疗只对一部分患者有效。如何能在用药前或用药时判断免疫治疗药物是否有效以及患者预后就显得非常关键。现有技术公开了一种能有效用于肿瘤特异性T细胞含量检测的检测颗粒、其相应的制备方法、包括其的试剂盒以及利用其进行肿瘤特异性T细胞含量检测的检测方法，在基于待测样品中的被激活的肿瘤特异性T细胞所分泌的细胞分泌物、被激活的肿瘤特异性T细胞的增殖状态或被激活的肿瘤特异性T细胞的细胞表面标志物中的任意一种或多种而进行该肿瘤特异性T细胞的含量的检测中用于激活肿瘤特异性T细胞。免疫疗法依托免疫系统被癌症特异性/相关性抗原激活的T细胞杀灭肿瘤细胞，因而病人体内癌症特异性T细胞的含量与免疫疗法的疗效密切相关。但是目前缺乏有效的手段全面准确地检测患者外周血中的癌症特异性T细胞含量。
技术实现思路
本专利技术提供一种检测外周组织中肿瘤特异性T细胞及其含量的方法，可以为癌症患者预后提供参考信息；肿瘤特异性T细胞与肿瘤细胞、肿瘤组织全细胞、肿瘤细胞裂解物组分、肿瘤组织全细胞裂解物组分或者负载裂解物组分的微纳粒子共孵育后被激活并分泌或表达一些特异性分子，通过检测所分泌或表达的这些特异性分子即可测定肿瘤细胞特异性T细胞的含量，其中关键技术在于T细胞的激活。本专利技术采用如下技术方案：肿瘤特异性T细胞的检测方法，包括以下步骤，将激活物与外周免疫细胞孵育，然后检测肿瘤特异性T细胞的特异性分子，实现肿瘤特异性T细胞的检测。肿瘤特异性T细胞含量的检测方法，包括以下步骤，将激活物与外周免疫细胞孵育，然后检测肿瘤特异性T细胞的特异性分子；再根据肿瘤特异性T细胞的数量与外周免疫细胞的数量比例得到肿瘤特异性T细胞的含量。本专利技术中，激活物包括肿瘤细胞、肿瘤组织全细胞、肿瘤细胞裂解物组分、肿瘤组织全细胞裂解物组分，还可以包括免疫佐剂，其中肿瘤细胞裂解物组分、肿瘤组织全细胞裂解物组分中的裂解物组分可以为水溶性裂解物组分，也可以为非水溶性裂解物组分，优选水溶性裂解物组分与非水溶性裂解物组分。本专利技术中，激活物可以为游离细胞或者游离裂解物组分，也可以为负载于微纳粒子上的裂解物组分；优选游离裂解物组分或者负载于微纳粒子上的裂解物组分；裂解物被负载于微纳粒子内部和/或表面。裂解物组分负载于微纳粒子内部和/或表面的方式包括但不限于非共价键吸附、静电相互作用、疏水相互作用、氢键相互作用、共价键等。本专利技术可以同时使用负载水溶性组分的微纳粒子和负载非水溶性组分的微纳粒子，也可以使用同时负载有水溶性和非水溶性组分的微纳粒子，或者使用只负载水溶性组分的微纳粒子，或者使用只负载非水溶性组分的微纳粒子。本专利技术中，孵育的条件为细胞可以生存的条件，如4℃～60℃，优选37℃；孵育的时间为1～100小时，比如5～70小时，优选10～50小时。本专利技术中，微纳粒子可以为有机材料、无机材料或生物材料，比如合成高分子材料、天然高分子材料或者无机材料。微纳粒子为微米粒子或者纳米粒子，其中纳米粒子的粒径为1nm～1000nm，优选为30nm～800nm，进一步的优选为50nm～600nm；微米粒子的粒径为1μm～1000μm，优选为1μm～100μm，进一步优选为1μm～10μm，最优选为1μm～5μm。具体微纳粒子的制备方法为现有技术，比如溶剂挥发法、透析法、挤出法、热熔法；微纳粒子的形状没有限定，比如球形、椭球形、桶形、多角形、线形、蠕虫形、方形、三角形、蝶形、圆盘形。本专利技术将细胞裂解物组分负载于微纳粒子的方法为溶剂挥发法，比如复乳法，也可采用其他可将细胞裂解物负载于微纳粒子的方法。具体的，激活物为负载于微纳粒子上的细胞裂解物组分时，制备方法为将水相溶液加入微纳粒子材料有机相溶液中，超声或搅拌或均质处理后将其加入第一乳化剂溶液，再经过超声或者搅拌或者均质处理，然后将其加入第二乳化剂溶液，搅拌后得到负载细胞裂解物组分的微纳粒子，作为激活物；举例包括以下步骤：（1）将水相溶液加入高分子材料有机相溶液中，超声或搅拌或均质处理后将其加入第一乳化剂溶液，再经过超声或者搅拌或均质处理，然后将其加入第二乳化剂溶液，搅拌后离心处理并重悬沉淀物得到剩余物或者超滤处理后得到剩余物；（2）将步骤（1）的剩余物冻干，再分散于分散液中；或者将步骤（1）的剩余物分散于分散液中，再加入水相溶液，混合后静置，得到作为激活物的微纳粒子。上述将其加入第二乳化剂溶液后，搅拌后离心或超滤处理，即可得到内部负载裂解物组分，或者裂解物组分/免疫佐剂的微纳粒子。进一步的，在上述内部负载裂解物组分或者裂解物组分/免疫佐剂的微纳粒子表面负载裂解物组分或者裂解物组分/免疫佐剂。上述水相溶液为裂解物组分溶液，或者裂解物组分/免疫佐剂溶液；超声为探头超声或者任何其他超声方式；搅拌为机械搅拌、磁力搅拌等，均质处理为高压均质处理或高剪切均质处理等。优选的，水相溶液为裂解物组分溶液时，其中蛋白质和多肽的浓度大于1ng/mL，优选1mg/mL～100mg/mL；水相溶液为裂解物组分/免疫佐剂溶液时，其中蛋白质和多肽的浓度大于1ng/mL，优选1mg/mL～100mg/mL，免疫佐剂的浓度大于0.01ng/mL，优选0.01mg/mL～20mg/mL。高分子材料有机相溶液中，溶剂为DMSO、乙腈、乙醇、氯仿、甲醇、DMF、异丙醇、二氯甲烷、丙醇、乙酸乙酯等，优选二氯甲烷；高分子材料的浓度为0.5mg/mL～5000mg/mL，优选为100mg/mL。第一乳化剂溶液优选为聚乙烯醇水溶液，浓度为10mg/mL～50mg/mL，优选20mg/mL。第二乳化剂溶液优选为聚乙烯醇水溶液，浓度为1mg/mL～20mg/mL，优选5mg/mL。分散液为PBS缓冲液或生理盐水或纯水。优选的，搅拌为机械搅拌或者磁力搅拌时，搅拌速度大于50rpm，搅拌时间大于1分钟，比如搅拌速度为50rpm～1500rpm，搅拌时间为0.5小时～5小时；超声处理时，超声功率为50W～500W，时间大于0.1秒，比如2～200秒；均质处理时使用高压/超高压均质机或高剪切均质机，使用高压/超高压均质机时压力大于20psi，使用高剪切均质机时转速大于1000rpm。超声或者搅拌或者均质处理进行纳米化，超声时间长短或搅拌速度或均质处理压力及时间能控制制备的纳米粒子大小，过大或过小都会带来粒径大小的变化。本专利技术中，水相溶液、高分子材料有机相溶液的体积比为1∶（1.1～5000），优选1∶（1.5～500）；高分子材料有机相溶液、第一乳化剂溶液的体积比为1∶（1.1～1000），优选1∶（1.5～500）；第一乳化剂溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.肿瘤特异性T细胞的检测方法，包括以下步骤，将激活物与外周免疫细胞孵育，然后检测肿瘤特异性T细胞的特异性分子，实现肿瘤特异性T细胞的检测；所述激活物包括肿瘤细胞、肿瘤组织全细胞、肿瘤细胞裂解物组分、肿瘤组织全细胞裂解物组分。/n

【技术特征摘要】
1.肿瘤特异性T细胞的检测方法，包括以下步骤，将激活物与外周免疫细胞孵育，然后检测肿瘤特异性T细胞的特异性分子，实现肿瘤特异性T细胞的检测；所述激活物包括肿瘤细胞、肿瘤组织全细胞、肿瘤细胞裂解物组分、肿瘤组织全细胞裂解物组分。


2.肿瘤特异性T细胞含量的检测方法，包括以下步骤，将激活物与外周免疫细胞孵育，然后检测肿瘤特异性T细胞的特异性分子；再根据肿瘤特异性T细胞的数量与外周免疫细胞的数量比例得到肿瘤特异性T细胞的含量；所述激活物包括肿瘤细胞、肿瘤组织全细胞、肿瘤细胞裂解物组分、肿瘤组织全细胞裂解物组分。


3.根据权利要求1或者2所述的检测方法，其特征在于，所述裂解物组分为水溶性裂解物组分和/或非水溶性裂解物组分。


4.根据权利要求1或者2所述的检测方法，其特征在于，所述裂解物组分为游离裂解物组分或者负载于微纳粒子上的裂解物组分。


5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述裂解物组分被负载于微纳粒子内部和/或表面。


6.根据权利要求4所述的检...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘密，马琳，刁璐，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32