一种甘胆酸均相酶免疫测定试剂盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种甘胆酸均相酶免疫测定试剂盒及其制备方法和应用，包括R1试剂和R2试剂，其中所述R1试剂中包括缓冲液、抗甘胆酸特异性抗体、L‑乳酸锂、稳定剂、防腐剂和表面活性剂；所述R2试剂中包括缓冲液、β‑NAD

【技术实现步骤摘要】
一种甘胆酸均相酶免疫测定试剂盒及其制备方法和应用
本专利技术属于生化检测体外诊断试剂
，具体涉及一种甘胆酸均相酶免疫测定试剂盒及其制备方法和应用。
技术介绍
肝脏疾病是危害人体健康的一大杀手，其中肝炎、肝硬化、肝癌等更是因其流行广泛、病程长、预后较差、死亡率高等特点而受到医学界的普遍关注。以血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及谷酰转肽酶(GGT)为代表的肝脏酶学指标可较好地反映肝细胞的病理状态，然而上述这些常规指标反映肝脏损害的特异性较差，会因为某些疾病、药物或生理原因导致指标检测无法准确反映肝脏的损害情况，如心脏疾病、胰腺疾病会导致血清ALT等升高。针对这些缺陷，甘胆酸的检测逐渐成为诊断肝脏疾病更为灵敏且特异性更好的指标，结合甘胆酸检测指标和其他指标的分析可以为肝脏疾病的诊断、治疗和预后分析提供更多的依据。此外，甘胆酸水平也是多种胆道系统疾病、妊娠期肝内胆汁淤积症及酒精性肝损伤等的重要诊断依据。市场上的甘胆酸均相酶免疫测定试剂盒，都是采用甘胆酸与6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联的，如专利CN106405069A公开了一种甘胆酸均相酶免疫诊断试剂的制备方法，其中包括甘胆酸酶偶联物溶液的制备，具体为：将甘胆酸加入到MES缓冲液中，加入羧基活化剂进行羧基活化，然后在羧基活化后的甘胆酸中加入6-磷酸葡萄糖脱氢酶进行缩合反应得到甘胆酸偶联物粗品，经透析纯化后加入到Tris-HCl缓冲液中并加入辅助试剂，混合均匀即为甘胆酸酶偶联物溶液。然而6-磷酸葡萄糖脱氢酶极易受到外界条件的影响，对温度、pH等易导致蛋白质变性的多种因素均非常敏感，因此，在与甘胆酸进行偶联反应时，对偶联条件的要求高，同时所制备的偶联物纯度不高、稳定性不好，进而导致制备得到的试剂盒的分析灵敏度低、热稳定性和长期稳定性较差。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的缺陷，提供了一种甘胆酸均相酶免疫测定试剂盒，通过选用稳定性更好的乳酸脱氢酶以替代6-磷酸葡萄糖脱氢酶，与甘胆酸进行偶联制备得到乳酸脱氢酶-甘胆酸偶联物，从而有效提高了甘胆酸均相酶免疫测定试剂盒的分析灵敏度、精密度以及稳定性。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种甘胆酸均相酶免疫测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，所述R1试剂中包括缓冲液、抗甘胆酸特异性抗体、L-乳酸锂、稳定剂、防腐剂和表面活性剂；所述R2试剂中包括缓冲液、β-NAD+、乳酸脱氢酶-甘胆酸偶联物、保护剂和防腐剂。该试剂盒的具体反应原理为：乳酸脱氢酶-甘胆酸偶联物通过甘胆酸与抗体结合后，乳酸脱氢酶的活性会被抑制，无法催化体系中β-NAD+的转化，而在检测样本时，由于样本中含有甘胆酸，其可与乳酸脱氢酶-甘胆酸偶联物竞争结合体系中的抗甘胆酸特异性抗体，从而释放了乳酸脱氢酶-甘胆酸偶联物，使乳酸脱氢酶的活性增强，进而催化L-乳酸锂和β-NAD+生成丙酮酸和NADH，其中NADH在340nm处有吸收峰，通过分析仪检测NADH的含量变化，并绘制相应的标准曲线，从而可通过检测NADH的含量变化计算得到样本中甘胆酸的浓度，通过选用稳定性更好的乳酸脱氢酶与甘胆酸偶联生成偶联物，可显著提高试剂盒的分析灵敏度、精密度、热稳定性和长期稳定性。进一步的，所述R2试剂中乳酸脱氢酶-甘胆酸偶联物和β-NAD+的体积质量比为1mL：1～5g。通过调节体系中乳酸脱氢酶-甘胆酸偶联物和β-NAD+的含量，可进一步提高试剂盒的各项性能。进一步的，所述R1试剂的pH为7.0～8.0，具体包括：50～500mM缓冲液，1～10g/L抗甘胆酸特异性抗体，0.5～5g/LL-乳酸锂，0.1～10g/L稳定剂，0.5～5mL/L防腐剂，质量浓度0.05～1％表面活性剂；所述R2试剂的pH为6.5～7.5，具体包括：50～500mM缓冲液，4～10g/Lβ-NAD+，1～5mL/L乳酸脱氢酶-甘胆酸偶联物，10～100g/L保护剂，0.5～5mL/L防腐剂。进一步的，所述缓冲液为HEPES缓冲液(N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)缓冲液)、PBS缓冲液(十二水合磷酸氢二钠—二水合磷酸二氢钠缓冲液)、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、Tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷缓冲液)、MOPS缓冲液(3-(N-吗啉代)丙磺酸缓冲液)、TAPSO缓冲液(3-[N-tris(羟甲基)甲基氨基]2-羟基丙磺酸缓冲液)、MES缓冲液(2-(N一吗啉代)乙磺酸缓冲液)、PIPES缓冲液(哌嗪-N,N-二(2-乙磺酸)缓冲液)、MOPSO缓冲液(3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸缓冲液)中的一种或多种。进一步的，所述稳定剂为EDTA·2Na、EDTA·3Na、EDTA·2NaMn、EDTA·Zn、PVP-K30(聚乙烯吡咯烷酮K30)、PVP-K90(聚乙烯吡咯烷酮K90)中的一种或多种。稳定剂可用于维持体系中抗体的稳定。进一步的，所述保护剂为蔗糖、海藻糖、葡聚糖、甘露醇、乳糖醇、山梨醇中的一种或多种。用于保护体系中的乳酸脱氢酶-甘胆酸偶联物，使其更稳定，避免失活。进一步的，所述表面活性剂为Tween-20、Tween-80、曲拉通X-100、Brij-35、Thesit、APG(烷基糖苷)中的一种或多种。进一步的，所述防腐剂为Proclin系列、KroVin系列中的一种或多种。本专利技术还提供了一种上述甘胆酸均相酶免疫测定试剂盒的制备方法，所述方法包括：S1、R1试剂的制备：向缓冲液中依次加入L-乳酸锂、抗甘胆酸特异性抗体、稳定剂、防腐剂和表面活性剂，定容得到R1试剂；S2、乳酸脱氢酶-甘胆酸偶联物的制备：将甘胆酸溶解后加入活化剂进行活化，然后加入乳酸脱氢酶进行偶联，得到乳酸脱氢酶-甘胆酸偶联物；S3、R2试剂的制备：向缓冲液中依次加入β-NAD+、乳酸脱氢酶-甘胆酸偶联物、保护剂和防腐剂，定容得到R2试剂。进一步的，步骤S2的具体为：①将甘胆酸溶解于MES缓冲液中，加入活化剂EDC进行活化，其中EDC和甘胆酸的质量比为1：50～500，在温度为18～42℃条件下搅拌活化5～20min；②活化后加入乳酸脱氢酶，其中乳酸脱氢酶和甘胆酸的质量比为1：50～500，在温度为18～42℃条件下搅拌偶联0.5～3h，得到乳酸脱氢酶-甘胆酸偶联物粗品；③将上述乳酸脱氢酶-甘胆酸偶联物粗品用PBS缓冲液进行透析提纯8～24h，即得到乳酸脱氢酶-甘胆酸偶联物。本专利技术还提供了一种上述甘胆酸均相酶免疫测定试剂盒的在检测甘胆酸含量中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术针对现有的甘胆酸均相酶免疫测定试剂盒稳定性差的缺陷，将体系中的6-磷酸葡萄糖脱氢酶更换为乳酸脱氢酶，从而显著提高了试剂盒的分析灵敏度、精密度、热稳定性和长期稳定性。本专利技术还通过调节体系中乳酸脱氢酶-甘氨酸偶联物与β-NAD+的含量，进一步提高了试剂盒的各项性能指标，从而得到了一种分析灵敏度高、精密度和稳定性均十分优异的甘胆酸均相酶免疫测定试剂盒。具体实施方式下面将结合本专利技术中的实施例，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甘胆酸均相酶免疫测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，其特征在于，所述R1试剂中包括缓冲液、抗甘胆酸特异性抗体、L-乳酸锂、稳定剂、防腐剂和表面活性剂；所述R2试剂中包括缓冲液、β-NAD

【技术特征摘要】
1.一种甘胆酸均相酶免疫测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，其特征在于，所述R1试剂中包括缓冲液、抗甘胆酸特异性抗体、L-乳酸锂、稳定剂、防腐剂和表面活性剂；所述R2试剂中包括缓冲液、β-NAD+、乳酸脱氢酶-甘胆酸偶联物、保护剂和防腐剂。


2.根据权利要求1所述的甘胆酸均相酶免疫测定试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中乳酸脱氢酶-甘胆酸偶联物和β-NAD+的体积质量比为1mL：1～5g。


3.根据权利要求1所述的甘胆酸均相酶免疫测定试剂盒，其特征在于，所述R1试剂的pH为7.0～8.0，具体包括：50～500mM缓冲液，1～10g/L抗甘胆酸特异性抗体，0.5～5g/LL-乳酸锂，0.1～10g/L稳定剂，0.5～5mL/L防腐剂，质量浓度0.05～1％表面活性剂；
所述R2试剂的pH为6.5～7.5，具体包括：50～500mM缓冲液，4～10g/Lβ-NAD+，1～5mL/L乳酸脱氢酶-甘胆酸偶联物，10～100g/L保护剂，0.5～5mL/L防腐剂。


4.根据权利要求1所述的甘胆酸均相酶免疫测定试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为HEPES缓冲液、PBS缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、TAPSO缓冲液、MES缓冲液、PIPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种或多种。


5.根据权利要求1所述的甘胆酸均相酶免疫测定试剂盒，其特征在于，所述稳定剂为EDTA·2Na、EDTA·3Na、EDTA·2NaMn、EDTA...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴年芬，龚婷，梁艳，赵畅，张雪娇，舒芹，
申请(专利权)人：武汉生之源生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42