一种AACT基因过表达试剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种AACT基因过表达试剂及其制备方法，所述方法包括如下：步骤：1）.以人cDNA文库为模板，设计带有

【技术实现步骤摘要】
一种AACT基因过表达试剂及其制备方法和应用
本专利技术涉及肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种AACT基因过表达试剂及其制备方法和应用。
技术介绍
肺癌是原发性恶性肿瘤，发病率和死亡率日益增加，位居第一，成为威胁人类健康的一大恶性肿瘤。肺癌可分为小细胞肺癌(Smallcelllungcancer，SCLC)和非小细胞肺癌(Non-smallcelllungcancer，NSCLC)，SCLC更加恶性，易转移，生存时间很短，晚期患者五年生存率约10-15%。而NSCLC发生发展比较缓慢，并且转移比较晚，临床病理中80%-85%的患者都为NSCLC，NSCLC主要包括腺癌(Adenocarcinoma,AD)、鳞状细胞癌(Squamous-cellcarcinoma,SCC)和大细胞癌(Largecellcarcinoma,LCC)三种组织亚型。近年来在肺癌的诊断与治疗上有了很多新的突破，尤其是NSCLC晚期患者的治疗已有诸多方案。然而，早期肺癌患者常常无明显的临床症状，临床早诊技术水平低、缺乏特异性诊断标志物，容易造成错诊和漏诊，早诊率仅10%-20%；70%的NSCLC患者诊断时已局部晚期或转移期，失去了最佳治疗时机，长期疗效仍相对较差，5年生存率仅为19.7%。未能及早发现肺癌使得有效治疗变得困难，是导致当前NSCLC患者高死亡率的主要原因。若能早期发现非小细胞肺癌，尤其是在免疫缺陷期，5年生存率可达85%以上。临床上较常见的肺癌筛查手段是低剂量螺旋CT（Low-dosecomputertomography,LDCT）和血清肿瘤标志物检查。LDCT辐射小，是标准CT辐射剂量的22%，相对安全，将肺癌患者死亡率降低了20%，但LDCT特异性低，假阳性率高达96%，易误诊，很小病灶可能发现不了。常见的肺癌血清标志物有癌胚抗原（Carcinoembryonicantigen,CEA）、细胞角蛋白片段19（Cytokeratin19fragment,CYFRA21-1）和鳞状细胞癌抗原（Squamouscellcarcinomaantigen,SCCA）等。①CEA是广谱的肿瘤标志物，30%~70%肿瘤患者血清中CEA水平升高。肺癌分期越高，CEA浓度越高，但CEA对晚期患者诊断较明显，早诊效果较差。②CYFRA21-1是诊断肺鳞癌相对较好的标志物，灵敏度为40%-60%。③SCCA检测肺鳞癌的灵敏度为15%-55%。虽然现有这些指标联合诊断效果优于单一指标，但总的来说，现有的肺癌早诊技术水平低，发现晚，缺乏高灵敏度和高特异性早诊标志物，达不到早发现、早诊断的要求，在早期筛查应用中有一定的局限性。此外，肺癌早期诊断的瓶颈是良恶性肿瘤难以区分，约30%不确定的肺部疾病患者经手术切除后组织活检为良性疾病，而手术会增加感染等风险。因此，迫切需要寻找高效灵敏的血清肿瘤生物标志物，以提高早期非小细胞肺癌患者的生存率，这一点具有重要意义。总的来说，如上所述，现有的肺癌早诊技术水平低，发现晚，缺乏高灵敏度和高特异性早诊标志物，达不到早发现、早诊断的要求，在早期筛查应用中有一定的局限性。目前现有的肺癌治疗方法主要包括手术、放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗等，放疗是晚期肺癌的主要治疗手段之一；标准化疗方案主要是以铂类为基础的联合治疗如紫杉醇、吉西他滨等；靶向治疗有靶向K-Ras的表皮生长因子-酪氨酸激酶抑制剂（EFGR-TKIs），如吉非替尼等；免疫治疗主要有PD-1和PD-L1抑制剂。虽然这些治疗方法对肺癌治疗已有较大改善，但仍旧副作用大，也由于肺癌类型多、病因复杂等现有药物使用具有一定的局限性，因此，仍需开发新的肺癌治疗可行途径。专利技术人前期研究发现α-1-抗胰凝乳蛋白酶(AACT)在NSCLC组织和血清中表达下降，可作为NSCLC早期诊断的标志物。AACT是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员之一，是人类血浆中最丰富的蛋白酶抑制子，能抑制多种蛋白酶。AACT由serpinA3基因编码，有423个氨基酸，分子量约48kDa。AACT主要在肝脏中合成，分泌到血液中，是血清中的糖蛋白，也在其他器官合成，包括肺部和脑部，主要是肺泡上皮细胞和脑星形胶质细胞。AACT主要是抑制组织蛋白酶和肥大细胞食糜酶，影响组织重塑。AACT也属于急性时相蛋白，参与炎症应答，在炎症反应中AACT浓度发生改变，是炎症性疾病监控的重要指标，在急性炎症环境中AACT高度糖基化，SLex糖型的岩藻糖基化修饰显著增加。AACT还参与神经系统性疾病的发生，在阿尔兹海默症的发生中发挥重要作用，在阿尔兹海默症患者的脑脊液和血清中表达水平升高，随着AACT浓度增加，Aβ淀粉样蛋白斑块沉积，且AACT通过活化c-JunN端激酶介导tau蛋白高度磷酸化导致神经纤维缠结，引起疾病的发生。研究报道在肺癌细胞中AACT的表达与肿瘤增长密切相关。但关于AACT在肺癌中的生物学功能还不清楚，因而尚待进一步研究。本专利技术运用分子生物学技术构建AACT基因过表达的载体，在细胞水平检测过表达AACT基因对NSCLC细胞增殖的影响，为肺癌治疗提供了新的工具。而且相比现有过表达方法，本专利技术采用重组克隆法构建AACT基因过表达载体，操作过程更简单、节省时间。
技术实现思路
本专利技术的目的在于客服现有技术存在的上述缺陷，提供一种成本低、效率高、环保，并且能够制备抑制肺癌细胞增殖的试剂的AACT基因过表达试剂的制备方法。为实现上述目的，本专利技术提供了一种制备AACT基因过表达试剂的方法，其特征在于包括如下步骤：1）以人cDNA文库为模板，设计带有EcoRI和XbaI酶切位点的引物，在启动子ATG前增加增强子序列GCCACC，PCR扩增得到产物编码区序列的AACT，即带有EcoRI和XbaI双酶切位点的目的基因AACT。2）将pCS2-HA空载体用EcoRI和XbaI进行双酶切，用胶回收试剂盒回收酶切产物，得到线性化pCS2-HA载体；3）将步骤1）得到的所述目的基因AACT与步骤2）得到的所述线性化pCS2-HA载体进行连接形成过表达载体pCS2-HA-AACT，即为所述AACT基因过表达试剂。优选地，所述步骤1）中以人cDNA文库为模板，设计引物，利用重组克隆法进行PCR扩增AACT基因编码序列全长，PCR扩增目的基因的引物序列为：上游引物为（Sequence1）：5′>CAGACTACGCTGGCCGGCCAGAATTCGCCACCATGGAGAGAATGTTACCTCTCC>3′，下划线部分为EcoRI酶切位点；下游引物为（Sequence2）：5′>GTAATACGACTCACTATAGTTCTACACTAGGCTTGCTTGGGATTGGTG>3′，下划线部分为XbaI酶切位点；PCR扩增目的基因的反应体系如下：PCR扩增条件如下：扩增30个循环，72℃后延伸5min后，将PCR扩增产物进行电泳、用胶回收试剂盒回收产物，得到PCR产物即所述带有EcoRI和Xba本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备AACT基因过表达试剂的方法，其特征在于包括如下步骤：/n1）以人cDNA文库为模板，设计带有

【技术特征摘要】
1.一种制备AACT基因过表达试剂的方法，其特征在于包括如下步骤：
1）以人cDNA文库为模板，设计带有EcoRI和XbaI酶切位点的引物，在启动子ATG前增加增强子序列GCCACC，PCR扩增得到产物编码区序列的AACT，即带有EcoRI和XbaI双酶切位点的目的基因AACT；
将pCS2-HA空载体用EcoRI和XbaI进行双酶切，用胶回收试剂盒回收酶切产物，得到线性化pCS2-HA载体；
将步骤1）得到的所述目的基因AACT与步骤2）得到的所述线性化pCS2-HA载体进行连接形成过表达载体pCS2-HA-AACT，即为所述AACT基因过表达试剂。


2.如权利要求1所述的制备AACT基因过表达试剂的方法，其特征在于：所述步骤1）中以人cDNA文库为模板，设计引物，利用重组克隆法进行PCR扩增AACT基因编码序列全长，PCR扩增目的基因的引物序列为：
上游引物为：
5′>CAGACTACGCTGGCCGGCCAGAATTCGCCACCATGGAGAGAATGTTACCTCTCC>3′，下划线部分为EcoRI酶切位点；
下游引物为：
5′>GTAATACGACTCAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：金艳霞，孙慧，王卫东，闫梦琴，詹艳，王琦昀，
申请(专利权)人：湖北师范大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42