一种新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：S1多肽合成、S2免疫原制备、S3制备筛选抗原、S4动物免疫、S5细胞融合、S6筛选检测、S7稳定细胞株建立、S8单克隆抗体生产、S9抗体偶联、S10配对抗体筛选；通过选择了N蛋白两端的不同抗原表位分别合成多肽作为抗原，制备的单克隆抗体可实现直接配对，并在多肽合成的过程中，添加连接桥减少了空间位阻，使抗原表位充分暴露在载体蛋白表面，使得抗原能够快速识别，选择了重组蛋白作为检测抗原，避免了筛选得到的抗体只识别多肽抗原，不识别N蛋白的风险，并且通过检测N蛋白的含量，能够直接检测样品中是否含有新型冠状病毒。

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备方法
本专利技术属于单克隆抗体制备
，具体涉及一种新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备方法。
技术介绍
2019年12月以来，陆续发现了多例不明原因肺炎病例，现已证实为一种新型冠状病毒感染引起的急性呼吸道传染病。基于目前的流行病学调查，潜伏期一般为3-7天，最长不超过14天。此次疫情临床表现以发热、乏力、干咳为主要表现。少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等症状。部分患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现，多在1周后恢复，世界卫生组织将本次引起病毒性肺炎病例的病原体命名为2019新型冠状病毒，即为SARS-CoV-2病毒，核衣壳蛋白(N蛋白)是冠状病毒中含量最丰富的蛋白质。现有的新型冠状病毒检测试剂盒中使用的检测抗体无法实现直接配对，且在检测抗体的制备过程中，由于抗原表位未充分暴露，使得抗原识别的速度降低，同时在制备检测抗体时，均使用冠状病毒作为抗原，而冠状病毒易与N蛋白结合，形成螺旋状核衣壳蛋白，使得检测结果准确度降低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备方法。本专利技术要解决的技术问题：现有的新型冠状病毒检测试剂盒中使用的检测抗体无法实现直接配对，且在检测抗体的制备过程中，由于抗原表位未充分暴露，使得抗原识别的速度降低，同时在制备检测抗体时，均使用冠状病毒作为抗原，而冠状病毒易与N蛋白结合，形成螺旋状核衣壳蛋白，使得检测结果准确度降低。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备方法，具体包括如下步骤：1多肽合成：合成N蛋白N端15个氨基酸序列的多肽，并添加连接桥与载体蛋白结合位点，制得NP-N多肽，合成N蛋白C端aa383-aa394序列的多肽，并添加连接桥与载体蛋白结合位点，制得NP-C多肽；2免疫原制备：马来酰亚胺活化载体蛋白匙孔血蓝蛋白后，将NP-N多肽和NP-C多肽分别与活化后的匙孔血蓝蛋白，在室温条件下，进行反应2h，制得KLH-NP-N免疫原和KLH-NP-C免疫原；3制备筛选抗原：构建N蛋白原核表达载体，将表达载体C端添加6*His标签，表达纯化制得NP-His筛选抗原；4动物免疫：分别用KLH-NP-N免疫原和KLH-NP-C免疫原免疫Balb/c小鼠，每只Balb/c小鼠每次免疫100ug，免疫3次，每次间隔时间两周；5细胞融合：第三次免疫后1周，分别取KLH-NP-N和KLH-NP-C组小鼠脾脏，将脾细胞分离成单细胞悬液，与处于对数期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按1:1比例混合，采用细胞融合仪进行细胞融合，融合后的KLH-NP-N和KLH-NP-C组细胞铺板至96孔细胞培养板中，添加HAT筛选试剂，培养5天后进行一次全换液；6筛选检测：将NP-His筛选抗原包被至酶标板中，分别对KLH-NP-N、KLH-NP-C组融合后的细胞上清利用NP-His筛选抗原进行间接ELISA筛选，保留阳性克隆；7稳定细胞株建立：对阳性克隆进行亚克隆，直至阳性检出率为100％，扩大培养并冻存保种，得到杂交瘤稳定细胞株；8单克隆抗体生产：用无血清发酵培养上述杂交瘤稳定细胞株，收集细胞培养上清，利用PronteinA亲和纯化单克隆抗体，制得初级N蛋白单克隆抗体；9抗体偶联：采用简易过碘酸钠法单克隆抗体与辣根过氧化物酶进行偶联，得到标记抗体；10配对抗体筛选：将未标记的抗体包被至酶标板中作为捕获抗体，将稀释后的NP-His筛选抗原加入酶标板中，进行培养，再加入标记抗体两两进行配对检测，筛选阳性孔，得到核衣壳蛋白配对单克隆抗体对。进一步，所述的NP-N多肽序列为：MSDNGPQNQRNAPRIGGGGSC，NP-C多肽列为：PQRQKKQQTVTLGGGGSC，NP-N多肽和活化后的匙孔血蓝蛋白的用量质量比为1:1，NP-C多肽和活化后的匙孔血蓝蛋白的用量质量比为1:1。进一步，动物免疫的具体步骤如下：将KLH-NP-N免疫原和与弗氏完全佐剂以质量比1:1的比例进行混合，制得第一混合液，将KLH-NP-C免疫原和弗氏完全佐剂以质量比1:1的比例进行混合，制得第二混合液，用第一混合液和第二混合也分别对6周龄的Balb/c小鼠进行皮下注射，每次注射位点个数为6个，每次注射量为100μg，得到初次免疫小鼠，将KLH-NP-N免疫原和弗氏不完全佐剂以质量比1:1的比例进行混合，制得第三混合液，将KLH-NP-C免疫原和弗氏不完全佐剂以质量比1:1的比例进行混合，制得第四混合液，用第三混合液和第四混合液分别对初次免疫两周后的小鼠重复免疫2次，每次间隔两周。进一步，细胞融合的具体步骤如下：分别取三次免疫后1周的KLH-NP-N和KLH-NP-C组小鼠脾脏，将小鼠脾脏放入盛有5mLDMEM液的培养皿中，将脾脏夹碎，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液，将单细胞悬液和于对数期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞液以体积比1:1的比例混合，采用细胞融合仪进行细胞融合，融合后细胞铺板至96孔细胞培养板中，添加HAT筛选试剂，培养5天后进行一次全换液。进一步，检测筛选的具体步骤：将NP-His筛选抗原包被至酶标板中，在温度为4℃的条件下，进行过夜培养后，用pH7.4的PBST洗涤三次，加封闭液37℃封闭2个小时后弃掉封闭液37℃烘干，分别将KLH-NP-N和KLH-NP-C组融合细胞的上清液每孔100μL加入酶标板中，在温度为37℃的条件下，进行温育60min后，将质量分数为0.5‰的羊抗小鼠IgG酶标二抗每孔100μL加入酶标板中，在温度为37℃的条件下，进行温育60min后，将TMB单组份显色液每孔100μL加入酶标板中，室温作用20min后，每孔加入50μL终止液，进行间接ELISA筛选，保留阳性克隆。进一步，稳定细胞株建立具体步骤如下：分别将KLH-NP-N和KLH-NP-C组阳性克隆采用有限稀释法对检测阳性的杂交瘤细胞及时进行克隆化培养，筛选阳性亚克隆，直至阳性检出率为100％，得到杂交瘤稳定细胞株。进一步，单克隆抗体生产具体步骤如下：采用无血清发酵分别培养KLH-NP-N和KLH-NP-C组杂交瘤稳定细胞株，收集细胞培养上清液，将上清液、PronteinA、pH为7.4的磷酸缓冲液进行混合后，加入层析柱中，用pH为7.4的磷酸缓冲液作为平衡液，用pH为4.0的柠檬酸溶液脱洗抗体，再用pH为9.0的Tris-HCl缓冲液调节pH值为7.0，收集抗体，得到初级N蛋白单克隆抗体。进一步，抗体偶联的具体步骤如下：步骤A1：将5mg辣根过氧化物酶溶于1mL去离子束中，制得辣根过氧化物酶溶液，将241mg高碘酸钠溶于10mL去离子水中，制得高碘酸钠溶液，将辣根过氧化物酶溶液加入高碘酸钠溶液中，在转速为200r/min，避光的室温条件下，进行搅拌20min后，得到混合液a，将混合液a加入透析袋中，对1mM，pH值4.4的醋酸钠缓冲液，在温度为4℃的条件下，进行过夜透析，得到混合液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：/n1多肽合成：合成N蛋白N端15个氨基酸序列的多肽，并添加连接桥与载体蛋白结合位点，制得NP-N多肽，合成N蛋白C端aa383-aa394序列的多肽，并添加连接桥与载体蛋白结合位点，制得NP-C多肽；/n2免疫原制备：马来酰亚胺活化载体蛋白匙孔血蓝蛋白后，将NP-N多肽和NP-C多肽分别与活化后的匙孔血蓝蛋白，在室温条件下，进行反应2h，制得KLH-NP-N免疫原和KLH-NP-C免疫原；/n3制备筛选抗原：构建N蛋白原核表达载体，将表达载体C端添加6*His标签，表达纯化制得NP-His筛选抗原；/n4动物免疫：分别用KLH-NP-N免疫原和KLH-NP-C免疫原免疫Balb/c小鼠，每只Balb/c小鼠每次免疫100ug，免疫3次，每次间隔时间两周；/n5细胞融合：第三次免疫后1周，分别取KLH-NP-N和KLH-NP-C组小鼠脾脏，将脾细胞分离成单细胞悬液，与处于对数期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按1:1比例混合，采用细胞融合仪进行细胞融合，融合后的KLH-NP-N和KLH-NP-C组细胞铺板至96孔细胞培养板中，添加HAT筛选试剂，培养5天后进行一次全换液；/n6筛选检测：将NP-His筛选抗原包被至酶标板中，分别对KLH-NP-N、KLH-NP-C组融合后的细胞上清利用NP-His筛选抗原进行间接ELISA筛选，保留阳性克隆；/n7稳定细胞株建立：对阳性克隆进行亚克隆，直至阳性检出率为100％，扩大培养并冻存保种，得到杂交瘤稳定细胞株；/n8单克隆抗体生产：用无血清发酵培养上述杂交瘤稳定细胞株，收集细胞培养上清，利用Prontein A亲和纯化单克隆抗体，制得初级N蛋白单克隆抗体；/n9抗体偶联：采用简易过碘酸钠法单克隆抗体与辣根过氧化物酶进行偶联，得到标记抗体；/n10配对抗体筛选：将未标记的抗体包被至酶标板中作为捕获抗体，将稀释后的NP-His筛选抗原加入酶标板中，进行培养，再加入标记抗体两两进行配对检测，筛选阳性孔，得到核衣壳蛋白配对单克隆抗体对。/n...

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
1多肽合成：合成N蛋白N端15个氨基酸序列的多肽，并添加连接桥与载体蛋白结合位点，制得NP-N多肽，合成N蛋白C端aa383-aa394序列的多肽，并添加连接桥与载体蛋白结合位点，制得NP-C多肽；
2免疫原制备：马来酰亚胺活化载体蛋白匙孔血蓝蛋白后，将NP-N多肽和NP-C多肽分别与活化后的匙孔血蓝蛋白，在室温条件下，进行反应2h，制得KLH-NP-N免疫原和KLH-NP-C免疫原；
3制备筛选抗原：构建N蛋白原核表达载体，将表达载体C端添加6*His标签，表达纯化制得NP-His筛选抗原；
4动物免疫：分别用KLH-NP-N免疫原和KLH-NP-C免疫原免疫Balb/c小鼠，每只Balb/c小鼠每次免疫100ug，免疫3次，每次间隔时间两周；
5细胞融合：第三次免疫后1周，分别取KLH-NP-N和KLH-NP-C组小鼠脾脏，将脾细胞分离成单细胞悬液，与处于对数期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按1:1比例混合，采用细胞融合仪进行细胞融合，融合后的KLH-NP-N和KLH-NP-C组细胞铺板至96孔细胞培养板中，添加HAT筛选试剂，培养5天后进行一次全换液；
6筛选检测：将NP-His筛选抗原包被至酶标板中，分别对KLH-NP-N、KLH-NP-C组融合后的细胞上清利用NP-His筛选抗原进行间接ELISA筛选，保留阳性克隆；
7稳定细胞株建立：对阳性克隆进行亚克隆，直至阳性检出率为100％，扩大培养并冻存保种，得到杂交瘤稳定细胞株；
8单克隆抗体生产：用无血清发酵培养上述杂交瘤稳定细胞株，收集细胞培养上清，利用PronteinA亲和纯化单克隆抗体，制得初级N蛋白单克隆抗体；
9抗体偶联：采用简易过碘酸钠法单克隆抗体与辣根过氧化物酶进行偶联，得到标记抗体；
10配对抗体筛选：将未标记的抗体包被至酶标板中作为捕获抗体，将稀释后的NP-His筛选抗原加入酶标板中，进行培养，再加入标记抗体两两进行配对检测，筛选阳性孔，得到核衣壳蛋白配对单克隆抗体对。


2.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的NP-N多肽序列为：MSDNGPQNQRNAPRIGGGGSC，NP-C多肽列为：PQRQKKQQTVTLGGGGSC，NP-N多肽和活化后的匙孔血蓝蛋白的用量质量比为1:1，NP-C多肽和活化后的匙孔血蓝蛋白的用量质量比为1:1。


3.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：动物免疫的具体步骤如下：将KLH-NP-N免疫原和与弗氏完全佐剂以质量比1:1的比例进行混合，制得第一混合液，将KLH-NP-C免疫原和弗氏完全佐剂以质量比1:1的比例进行混合，制得第二混合液，用第一混合液和第二混合也分别对6周龄的Balb/c小鼠进行皮下注射，每次注射位点个数为6个，每次注射量为100μg，得到初次免疫小鼠，将KLH-NP-N免疫原和弗氏不完全佐剂以质量比1:1的比例进行混合，制得第三混合液，将KLH-NP-C免疫原和弗氏不完全佐剂以质量比1:1的比例进行混合，制得第四混合液，用第三混合液和第四混合液分别对初次免疫两周后的小鼠重复免疫2次，每次间隔两周。


4.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：细胞融合的具体步骤如下：分别取三次免疫后1周的KLH-NP-N和KLH-NP-C组小鼠脾脏，将小鼠脾脏放入盛有5mLDMEM液的培养皿中，将脾脏夹碎，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液，将单细胞悬液和于对数期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞液以体积比1:1的比例混合，采用细胞融合仪进行细胞融合，融合后细胞铺板至96孔细胞培养板中，添加HAT筛选试剂，培养5天后进行一次全换液。


5.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：检测筛选的具体步骤：将NP-His筛选抗原包被至酶标板...

【专利技术属性】
技术研发人员：雍金贵，张志鹏，张磊，缪连军，
申请(专利权)人：通用生物系统安徽有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34