化学合成的具有抗细菌、真菌作用的二聚体多肽、制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种化学合成的具有抗细菌、真菌作用的二聚体多肽、制备方法及其应用，属于生物医药领域。该多肽通过常规的多肽固相合成技术分成两个片段进行中间体肽段的制备，再通过半胱氨酸残基侧链的巯基基团形成分子内二硫键进行偶联，最后经半制备反向高效液相色谱纯化得到。抗菌实验研究结果表明该多肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌均具有良好的抑制作用。更重要的是，该二聚体多肽呈现出低溶血活性、耐盐、耐高温、耐酸碱的特性，且人工制备便捷、抗菌谱广，具有作为候选药物进行深入研发的价值以及产业化的潜力。

【技术实现步骤摘要】
化学合成的具有抗细菌、真菌作用的二聚体多肽、制备方法及其应用
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种化学合成的具有抗细菌、真菌作用的二聚体多肽、制备方法及其应用。
技术介绍
全球每年因微生物感染而导致上千万人死亡。尽管抗生素以及合成抗菌药曾经能够治疗大多数感染，但随着病原微生物耐药性的越来越严重，已削弱了现有抗微生物药物的有效性。目前临床上使用的抗微生物药物不易抵抗因菌株进化所产生的耐药机制的影响，因此给临床治疗带来了极大的挑战。根据全国细菌耐药监测网2019年11月19日发布的《全国细菌耐药监测报告》，该报告统计、分析了2017年10月至2018年9月我国的监测数据。纳入分析的细菌总数为3234372株，其中革兰氏阳性菌952023株(占29.4％)，革兰氏阴性菌2282349株(占70.6％)。革兰氏阳性菌分离率排名前五位的是：金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌(分别占革兰氏阳性菌的32.5％、10.7％、10.5％、9.6％以及9.5％)。革兰氏阴性菌分离率排名前五位的是：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和阴沟肠杆菌(分别占革兰氏阴性菌的28.9％、20.4％、12.4％、9.9％以及4.0％)。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)我国的平均检出率为30.9％；耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)平均检出率为75.7％；粪肠球菌、屎肠球菌对万古霉素耐药率平均分别为0.3％和1.4％；大肠埃希菌对第三代头孢菌素、碳青霉烯类、喹诺酮类药物耐药率分别为53％、1.5％和50.8％；肺炎克雷伯菌对第三代头孢菌素、碳青霉烯类药物的耐药率约为32.4％和10.1％；铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物耐药率约为19.3％；鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物的耐药率约为56.1％。多药耐药的微生物不仅出现在医院环境中，而且现在经常在社区环境中被发现，这表明医院之外同样存在着大量抗生素耐药的菌株。菌株对抗菌药物“攻击”的反应是微生物适应和进化结果。“优胜劣汰”是病原体巨大的遗传可塑性的必然结果，菌株可引起特定的反应，从而通过突变、遗传物质的改变或基因表达的改变而适应并生存。经过不断的累积，使其对目前临床上使用的几乎所有抗菌药均获得不同程度的抗性。因此，了解微生物药耐产生的生化和遗传基础对于优化新药设计策略以减少抗药性的出现和传播，以及针对多药耐药菌株开创新治疗方法至关重要。抗菌肽(antibacterialpeptides,AMP)是具有生物活性的小蛋白，它们通过破坏菌株细胞膜，调节免疫反应和调节炎症来发挥作用。AMP具有序列和结构的多样性，同时也具有多重药理学作用，这种特性是目前抗生素和合成抗菌药所不具备的。除了将AMP用于抗菌之外，它们还可用于控制植物病害。天然AMP的合成类似物已在转基因植物中表达以赋予植物自我保护功能、防止感染，并用作商业生物农药的活性成分(MontesinosE,EduardBardají.SyntheticAntimicrobialPeptidesasAgriculturalPesticidesforPlant-DiseaseControl[J].ChemBiodivers,2008,5(7):1225-1237)。相关研究表明，重组或合成的AMP可以作为水产养殖中的治疗剂，或者牲畜的食品添加剂(LiuQ,YaoS,ChenY,etal.Useofantimicrobialpeptidesasafeedadditiveforjuvenilegoats[J].SciRep,2017,7(1):12254.)。自亚历山大·弗莱明(AlexanderFleming)于1922年发现溶菌酶后，直到上世纪90年代中期，才从细菌或真菌感染后的果蝇种鉴定出第一个AMP。果蝇中防御素的3D结构类似于人的β-防御素，是AMP中的一类。抗菌剂耐药性的增长和加速了对新型抗菌剂开发的需求。抗菌肽相对于常规抗生素和合成抗菌药剂具有明显的优势，主要包括耐药性出现较慢，广谱的抗生物膜活性以及具有调节宿主免疫反应的能力。抗菌肽对细菌、真菌等微生物广泛的敏感性同时也为研究微生物的耐药机制以及生物进化提供了另外一种工具。已有许多肽被鉴定为具有不同功效谱的抗菌剂。AMP的多功能性对于药物和临床开发既有好处，也有缺点，因为有许多潜在可能的药物靶标，但同时也可能导致一些副作用。AMP的使用需要微生物学，药物化学和临床前研究的有机结合，尤其是在临床前领域(药代动力学，制剂以及吸收，分布，代谢，排泄和毒性，即ADME-Tox研究)。天然多肽以及化学合成肽仍有许多未知的特性需要研究，特别是在全身毒性方面。人工合理地设计多肽序列以及优化合成策略可以克服天然序列在体外抗菌活性、克服在稳定性等成药性质方面的不足，规避后续开发的风险。目前，AMP的开发更倾向于局部给药而不是全身给药，这可以降低研发的难度和风险。通过实验和理论药理学的方法，可以提供有针对性策略，人工进行对天然AMP的改造、研究结构—活性关系，预测分子的相关毒性。目前，天然AMPs研究的较多，但是人工设计的具有广谱抗菌活性且具有良好成药性的人工分子却相对较少。因此，通过人工设计，研发易于制备、活性优良、毒性小以及成药性好的非天然多肽，使其能作为候选的生物药物具有十分重要的意义，也是创新多肽药物发展的重要方向。
技术实现思路
为了弥补现有技术的缺点与不足，克服抗菌肽的活性较低、抗菌谱较窄等问题。首先，本专利技术首先提供了一种化学合成的具有抗细菌、真菌作用的二聚体多肽。该多肽可通过固相合成方法制备中间体肽段，经反向高效液相色谱法纯化后，再通过半胱氨酸侧链巯基形成的二硫键偶联，从而获得最终的多肽分子。其次，本专利技术同时提供了该具有抗细菌、真菌活性的二聚体多肽的制备方法，本专利技术所提供的方法技术路线易于操作，制备工艺稳定性较强，合成的肽段中间体以及最终所获得的完整分子质量易于控制，能满足大规模制备及工业化生产的需要。再次，本专利技术的另一目的在于提供上述具有抗细菌、真菌作用的二聚体多肽的应用。本专利技术所涉及的二聚体多肽在浓度为μM水平时具有抗革兰氏阳性菌、抗革兰氏阴性菌以及真菌的活性。同时，该化学合成、制备的二聚体多肽的具有抗细菌、真菌的作用。除了对标准菌株具有良好的药理活性外，对临床分离的耐药菌株也具有较好的抑制作用。本专利技术的目的可以通过以下述技术方案实现：第一方面，本专利技术提供一种具有抗细菌及真菌功能的二聚体多肽，所述二聚体多肽由单体1和单体2通过各单体末端的半胱氨酸形成单体间的二硫键制得；其中，所述的单体1选自SEQIDNO:1(多肽片段序列：KKKRVSRSARAGLQFPVGRIHRHLKAC)所示的氨基酸序列，所述的单体2选自SEQIDNO:2(多肽片段序列：CAFKKRRWQWKGM)所示的氨基酸序列，该二聚体多肽共由40个氨基酸残基组成，理论分子量为4823.84，理论等电点约为12.14，为具有较强碱性的阳离子多肽。第二方面，本专利技术提供一种上述具有抗细菌及真菌功能的二聚体多肽的制备方法，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种化学合成的具有抗细菌、真菌功能的二聚体多肽，其特征在于：所述二聚体多肽由单体1和单体2通过其氨基酸序列中半胱氨酸残基上的巯基形成单体间的二硫键来偶联；所述的单体1为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述的单体2为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，该二聚体多肽共由40个氨基酸残基组成，理论分子量为4823.84，理论等电点12.14，为强碱性阳离子肽。/n

【技术特征摘要】
1.一种化学合成的具有抗细菌、真菌功能的二聚体多肽，其特征在于：所述二聚体多肽由单体1和单体2通过其氨基酸序列中半胱氨酸残基上的巯基形成单体间的二硫键来偶联；所述的单体1为SEQIDNO:1所示的氨基酸序列，所述的单体2为SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，该二聚体多肽共由40个氨基酸残基组成，理论分子量为4823.84，理论等电点12.14，为强碱性阳离子肽。


2.一种制备如权利要求1所述化学合成的具有抗细菌、真菌功能的二聚体多肽的方法，其特征在于：
所述方法为：通过FMOC固相多肽合成法分别制备序列为SEQIDNO:1的单体1和序列为SEQIDNO:2的单体2，经反相高效液相色谱分离纯化及质谱测定分子量可获得中间产物；在离子型缓冲液介质Tris-HClbuffer中，利用单体1和单体2末端半胱氨酸的巯基，通过分子间二硫键配对将两个肽段连接起来，再经RP-HPLC纯化可获得终产物。


3.一种如权利要求1所述化学合成的具有抗细菌、真菌功能的二聚体多肽在制备具有抗细菌和/或抗真菌药剂中的应用。


4.根据权利要求3所述化学合成的具有抗细菌、真菌功能的二聚体多肽在制备具有抗细菌和/或抗真菌药剂中的应用，其特征在于：所述的细菌为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈秉正，周本宏，刘刚，吴玥，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42