一种应用于对苯二酚废水低温降解的突变蛋白及构建方法技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种应用于对苯二酚废水低温降解的突变蛋白及构建方法。所述应用于对苯二酚废水低温降解的突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，包含突变蛋白hqdA

【技术实现步骤摘要】
一种应用于对苯二酚废水低温降解的突变蛋白及构建方法
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种应用于对苯二酚废水低温降解的突变蛋白及构建方法。
技术介绍
化学工业排放的废水中含酚废水是一类难处理的废水，由于低含量的酚类物质就可以有效杀灭微生物。因此化学工业产生的含酚废水无法直接排放至污水处理池中。现在主要应用于含酚废水中酚类物质降解的手段为铁碳降解法：铁碳可以在酸性水中形成微电极，这些微电极可以将酚类物质电离分解。经过铁碳反应处理后的废水中酚含量大幅度降低，不会对污水降解微生物产生杀灭作用。此时该废水方可排放至污水处理池中。由于中国北方大部分地区在秋冬季温度相对较低，铁碳反应无法有效的降解废水中的酚类物质，因此很难达到排放至污水处理池微生物处理的标准。目前已报道用于对苯二酚降解的基因是hqdA与hqdB，它们均来自Sphingomonassp.strainTTNP3。在菌体内hqdA与hqdB共表达的蛋白可以形成二聚体共同催化降解对苯二酚。通过对HqdA与HqdB二聚体蛋白纯化后研究其催化动力学发现，该蛋白在常温下催化降解对苯二酚的效率为1.4mol对苯二酚/mol蛋白，其催化对苯二酚降解的Km＝2.2μM。然而该酶却在4℃下降解对苯二酚的能力相对较弱，其催化效率仅为常温下催化效率的1/35，无法在低温状态下对对苯二酚降解。本专利技术具体提供了一种利用易错PCR技术对hqdA和hqdB进行定向进化，对突变体进行筛选后选出突变蛋白HqdAmu和HqdBmu，应用大肠杆菌对HqdAmu和HqdBmu进行重组共表达，对pETduet-1-hqdABmu2进行培养后进行高密度发酵和蛋白表达诱导得到诱导发酵液，然后从发酵液中分离出大肠杆菌进行破碎后即得到突变蛋白的大肠杆菌裂解液。本专利技术制备的突变蛋白，具有低温下高效降解含酚废水的特点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种应用于对苯二酚废水低温降解的突变蛋白，所述的突变蛋白能够在低温状态下高效降解含酚废水。本专利技术的另一目的是提供上述应用于对苯二酚废水低温降解的突变蛋白的构建方法和应用。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种突变蛋白，所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。所述突变蛋白包含突变蛋白hqdAmu和突变蛋白hqdBmu，所述突变蛋白hqdAmu的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，突变蛋白hqdBmu的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。所述突变蛋白hqdAmu是将蛋白hqdA的第17位的甘氨酸、第88位的亮氨酸和第133位的缬氨酸分别突变为精氨酸、天冬氨酸和组氨酸；所述突变蛋白hqdBmu是将蛋白hqdB的第39位的甲硫氨酸和第148位的谷氨酸分别突变位缬氨酸和赖氨酸。一种应用于对苯二酚废水低温降解的突变蛋白的构建方法，包括如下步骤：步骤一、分别以鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.strain)基因组为PCR扩增模板，利用PCR扩增引物P1、P2扩增hqdA，利用PCR扩增引物P3、P4扩增hqdB，其中P1、P2、P3、P4的核苷酸序列如下：P1：AAGGATCCGATGGCCGACGTGGTCACC；P2：GCAAGCTTTCAGGCCGCCTCGGTCTGG；P3：AACATATGATGGCTATGTCCGAAGCACTTG；P4：AACTCGAGTCAGAAAGTGACCGGGACCAC；分别对扩增产物进行纯化和酶切，将酶切产物分别连接至大肠杆菌共表达载体pETduet-1中构建得到pETduet-1-hqdA和pETduet-1-hqdB；步骤二、利用PCR扩增引物P3、P4以及易错PCR试剂盒扩增hqdB，利用PCR扩增引物P1、P2以及易错PCR试剂盒扩增hqdA，分别对扩增产物进行纯化和酶切，将酶切产物分别连接至步骤一得到的pETduet-1-hqdA和pETduet-1-hqdB中构建得到pETduet-1-hqdABmu和pETduet-1-hqdBAmu；步骤三、将步骤二得到的pETduet-1-hqdABmu和pETduet-1-hqdAmuB分别转化入大肠杆菌BL21中进行菌落培养，得到的菌落转入TB培养基进行菌株培养；步骤四、分别以大肠杆菌最优密码子进行序列优化并全基因合成hqdAmu和hqdBmu后将其分别构建至大肠杆菌共表达载体pETduet-11中，构建得到pETduet-1-hqdABmu2；步骤五、将pETduet-1-hqdABmu2转化至大肠杆菌BL21中培养后接种至培养基进行高密度发酵，发酵16-20h后，流加5-13L补料液，流加时间为4-10h，流加完毕后加入灭菌的酵母提取物至其终浓度为1-4％，加入浓度为0.1-0.8mM的IPTG于20-28℃下诱导过夜得到发酵液，诱导过程中流加5-13L诱导补料液，流加时间为12-24h，流加完毕后从发酵液中分离出大肠杆菌制备得到突变蛋白。优选的，所述的步骤三中大肠杆菌BL21在含有0.005-0.015g/L的对苯二酚、0.1-0.8mMIPTG的LB固体培养基中在14℃-20℃培养48-60h。由于大肠杆菌对对苯二酚极其敏感，在含有0.005-0.015g/L的对对苯二酚培养基中就会死亡，因此需要加入IPTG。优选的，所述的步骤五中接种中采用大肠杆菌高密度发酵培养基，接种比例为1：50-1：100。优选的，所述的步骤五中补料液由葡萄糖、硫酸镁、维生素和微量元素组成；优选的，所述的步骤五中诱导补料液由甘油、硫酸镁、维生素B1和微量元素组成。突变蛋白在含酚废水低温降解中的应用。本专利技术的有益效果为：本专利技术所提供的突变蛋白，与野生型蛋白相比，在20-25℃下降解对苯二酚的能力获得了提高，但无显著性区别；在低温2-4℃下降解对苯二酚的能力为野生型蛋白的27.3倍，酶活显著性提高，其催化活性为6.4μmol/min/mg。将大肠杆菌裂解液按不同比例稀释添加至含有1g/L对苯二酚的废水中，检测发现14-24g的大肠杆菌裂解液在4℃下对1吨含有0.5-2g/L对苯二酚废水处理8-16h后对苯二酚含量仅为20-80ppm。对苯二酚的含量显著性下降，即本专利技术所制备的突变蛋白能够在低温环境下降解对苯二酚，且降解的活性极高。附图说明图1pETduet-1-hqdABmu2的构建过程图2在25℃、4℃下野生型蛋白与突变蛋白酶活催化效率的柱状对比图其中Wt25摄氏度为野生型蛋白在25℃下的酶活催化效率，Wt4摄氏度为野生型蛋白在4℃下的酶活催化效率，Mu25摄氏度为突变型蛋白在25℃下的酶活催化效率，Mu4摄氏度为突变型蛋白在4℃下的酶活催化效率。图3在低温下(4℃)利用高密度表达突变蛋白的大肠杆菌发酵液(14g/t)处理500ppm的对苯二酚废水后，废水中对苯二酚浓度随时间的变化趋势图，横坐标是处理时间，纵坐标是废水中对苯二酚浓度。图4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种应用于对苯二酚废水低温降解的突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种应用于对苯二酚废水低温降解的突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.如权利要求1所述的突变蛋白，其特征在于，所述的突变蛋白包含突变蛋白hqdAmu和突变蛋白hqdBmu，所述突变蛋白hqdAmu的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，突变蛋白hqdBmu的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。


3.如权利要求2所述的突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白hqdAmu是将蛋白hqdA的第17位的甘氨酸、第88位的亮氨酸和第133位的缬氨酸分别突变为精氨酸、天冬氨酸和组氨酸；所述突变蛋白hqdBmu是将蛋白hqdB的第39位的甲硫氨酸和第148位的谷氨酸分别突变为缬氨酸和赖氨酸。


4.一种应用于对苯二酚废水低温降解的突变蛋白的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括如下步骤：
步骤一、以鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.strain)基因组为PCR扩增模板，利用PCR扩增引物P1、P2扩增hqdA，利用PCR扩增引物P3、P4扩增hqdB，其中P1、P2、P3、P4的序列分别为：
P1：AAGGATCCGATGGCCGACGTGGTCACC；
P2：GCAAGCTTTCAGGCCGCCTCGGTCTGG；
P3：AACATATGATGGCTATGTCCGAAGCACTTG；
P4：AACTCGAGTCAGAAAGTGACCGGGACCAC；
分别对扩增产物进行纯化和酶切，将酶切产物分别连接至大肠杆菌共表达载体pETduet-1中构建得到pETduet-1-hqdA和pETduet-1-hqdB；
步骤二、利用PCR扩增引物P3、P4以及易错PCR试剂盒扩增hqdBmu，利用PCR扩增引物P1、P2以及易错PCR试剂盒扩增hqdAmu，分别对扩增产物进行纯化和酶切，将酶切产物分别连接至步骤一得到的pETduet...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙海丽，高天鹏，常国华，刘涛，台喜生，陈映全，张威，陈熙明，刘光琇，
申请(专利权)人：兰州城市学院，
类型：发明
国别省市：甘肃;62