EFTUD2应用及Epro-LUC-HepG2建模法制造技术

本发明专利技术为EFTUD2应用及Epro‑LUC‑HepG2建模法。EFTUD2蛋白可以通过剪接作用调节固有免疫信号通路中关键信号分子RIG‑1、MDA5 mRNA的生成，从而影响干扰素刺激基因（ISGs）的生成来抑制HBV复制。本发明专利技术通过以EFTUD2为靶点建立稳定的化合物筛选细胞模型，可以供研究和发掘新的分子靶向药物。在该模型基础上筛选能够上调EFTUD2基因表达化合物，为HBV慢性感染患者尤其临床IFN‑α治疗应答不佳患者提供更多的治疗选择。

【技术实现步骤摘要】
EFTUD2应用及Epro-LUC-HepG2建模法
本专利技术涉及基因领域，具体的说涉及EFTUD2为靶点的应用及建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型的方法。
技术介绍
乙型肝炎病毒(HBV)是一种具有高度种属特异性和组织特异性的部分环状双链DNA病毒。其感染会引起肝功能异常、肝炎，部分患者后期会进展为肝硬化甚至肝癌。我国是HBV感染重度流行国家，约有9000万HBV慢性感染者，其中有2800万人迫切需要抗病毒治疗，有700万人正在承受着晚期肝病的痛苦和向肝癌转化的风险。目前用于治疗乙肝病毒(HBV)慢性感染的两种药物干扰素(IFN)和核苷酸类似物(NAs)对慢性乙型肝炎(CHB)的治愈率仍不理想。
技术实现思路
专利技术人临床观察发现，HBV慢性感染患者体内EFTUD2基因的表达水平较非感染患者偏低。CHB患者中干扰素应答不佳者EFTUD2表达水平低。专利技术人发现，EFTUD2蛋白可以通过剪接作用调节固有免疫信号通路中关键信号分子RIG-1、MDA5mRNA的生成，从而影响干扰素刺激基因(ISGs)的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.EFTUD2蛋白作为抑制HBV复制的物质的应用，EFTUD2蛋白通过剪接作用调节固有免疫信号通路中关键信号分子RIG-1、MDA5 mRNA的生成，从而影响干扰素刺激基因ISGs的生成来抑制HBV复制的应用。/n

【技术特征摘要】
1.EFTUD2蛋白作为抑制HBV复制的物质的应用，EFTUD2蛋白通过剪接作用调节固有免疫信号通路中关键信号分子RIG-1、MDA5mRNA的生成，从而影响干扰素刺激基因ISGs的生成来抑制HBV复制的应用。


2.EFTUD2靶点建立稳定的化合物筛选细胞模型的应用。


3.一种建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型的方法，其特征在于以EFTUD2为靶点，包括如下步骤：
步骤S1、融合PCR技术获得目的序列Epro0.5-LUC
通过融合PCR技术将hEFTUD2pro-0.5kb启动子序列与萤火虫荧光素酶报告基因整合成融合基因；
步骤S2、构建LV6-Epro-LUC重组慢病毒
通过XbaI和BamHI双酶切将融合基因同源重组进LV6载体中构建LV6-Epro0.5-LUC穿梭质粒，LV6-Epro0.5-LUC穿梭质粒同包装质粒一起转染293T细胞，进行慢病毒包装，并进行滴度检测，获得LV6-Epro0.5-LUC慢病毒；
步骤S3、LV6-Epro0.5-LUC慢病毒感染HepG2细胞
用LV6-Epro0.5-LUC慢病毒感染HepG2细胞，感染后换新鲜完全培养基继续培养；
步骤S4、建立Epro-LUC-HepG2单克隆稳转株
对长出的多克隆细胞通过有限稀释法挑选出单克隆细胞株，对单克隆细胞株进行测序验证目的序列是否克隆进细胞基因组，并通过荧光素酶实验检测单克隆细胞株的荧光素酶活性，挑选出活性最高的细胞株进行扩大培养，建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型。


4.根据权利要求3所述的建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型的方法，其特征在于：还包括嘌呤霉素致死浓度筛选的步骤，筛选出能够完全杀死HepG2细胞的最适puro浓度；
步骤S4中所述有限稀释法所采用的培养基为能够完全杀死HepG2细胞的最适puro浓度培养基。


5.根据权利要求3所述的建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型的方法，其特征在于：步骤S1包括第一轮PCR反应和第二轮PCR反应，通过2轮PCR反应获得单一的目的Epro0.5-LUC条带；
第一轮PCR反应:分别获得hEFTUD2pro-0.5kb和LUC两段序列；
分别以前期PCR反应获得的hEFTUD2pro-0.5kb基因序列和Luciferase基因序列作为模板，经一轮PCR反应得到基因片段一hEFTUD2pro-0.5kb和基因片段二LUC；
第一轮PCR反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收Epro0.5-LUC基因片段一hEFTUD2pro-0.5kb和基因片段二LUC；
第一轮PCR反应:用EpL-CEF和EpL-CER引物进行第二轮PCR反应，模板为第一轮PCR反应产物经电泳回收后的Epro0.5-LUC基因片段一hEFTUD2pro-0.5kb和基因片段二LUC；
所述片段一hEFTUD2pro-0.5kb为hEFTUD2pro-0.5kb启动子序列；
所述基因片段二LUC为萤火虫荧光素酶报告基因；
所述Epro0.5-LUC条带为整合成的融合基因。


6.根据权利要求3所述的建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型的方法，其特征在于：
通过XbaI和BamHI双酶切将融合基因同源重组进LV6载体中构建LV6-Epro0.5-LUC穿梭质粒的步骤包括：
（1）LV6载体双酶切
用XbaI和BamHI对LV6载体在酶切体系下进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，然后用DNA凝胶回收试剂盒回收载体psiCHECK-2和载体LV6条带；
（2）目的序列克隆到线性LV6载体
利用ClonExpress®EntryOneStepCloningKit试剂盒，在反应体系下将扩增回收好的Epro0.5-LUC目的片段，重组克隆到线性化的LV6载体中；使用移液器上下吹打反应体系数次，混匀各组分，置于恒温箱中反应，反应完成后将反应管置于冰水浴中，冷却；
（3）琼脂糖凝胶电泳
将DNA与10╳DNAloadingBuffer按比例混合，每个加样槽加入样品；
加样后接通电源进行电泳，控制电场强度，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿处时,停止电泳；
染色：电泳结束后，取出凝胶，推入EB染色液中，浸泡进行染色；
拍照：取出染色后的凝胶，用水冲洗胶体表面的染色液，将凝胶置于凝胶成像系统的样品板上，在紫外灯下观察并拍照记录电泳图谱；
（4）DNA片段回收
将无水乙醇加入到漂洗液PW中；
柱平衡步骤：向吸附柱CA2中加入平衡液BL，室温下离心，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
在凝胶成像系统紫外灯...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱传龙，李毓雯，徐瑞瑞，宁琴，罗小平，李军，胡平平，
申请(专利权)人：江苏省人民医院南京医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32