【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】聚底物及其使用方法相关申请的交叉引用本申请要求2018年5月11日提交的美国临时申请No.62/670,627的优先权权益，其全部内容通过引用合并于此。
技术介绍
对用于核酸测序和重测序的低成本、高通量方法的需求导致了“大规模并行测序”(MPS)技术的发展。一种常用的DNA测序方法称为“合成测序”(SBS)。参见Blackburnetal.,Curr.Genomics16(3):159-174(2015)；StranneheimandLundeberg,Biotechnol.J.7:1063-73(2012)；和Guoetal.,Acc.Chem.Res.43:551-563(2010)。SBS需要与被测序的寡核苷酸或DNA模板相对的受控(即每次一个)的正确互补核苷酸的掺入。这使得在每次一个地对每个核苷酸残基进行测序时能通过在多个循环中添加核苷酸来进行精确测序，因此可以防止发生一系列不受控制的掺入。在一种方法中，可逆终止子核苷酸(RT)用于确定DNA模板的序列。在最常用的SBS方法中，每个RT都包含修饰的核苷酸，该核苷酸包括(1)...
【技术保护点】
1.一种包含聚底物的组合物，其中所述聚底物包含：/n(i)聚合物分子，/n(ii)附着于所述聚合物分子的多个底物分子，和/n(iii)附着于所述聚合物分子的结合部分，/n其中所述底物分子是发光酶底物；并且/n其中所述结合部分特异性结合至：/n(a)引物延伸产物的3'末端核苷酸，或/n(b)第二结合部分，并且所述第二结合部分与引物延伸产物的3'末端核苷酸特异性结合。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180511 US 62/670,6271.一种包含聚底物的组合物，其中所述聚底物包含：
(i)聚合物分子，
(ii)附着于所述聚合物分子的多个底物分子，和
(iii)附着于所述聚合物分子的结合部分，
其中所述底物分子是发光酶底物；并且
其中所述结合部分特异性结合至：
(a)引物延伸产物的3'末端核苷酸，或
(b)第二结合部分，并且所述第二结合部分与引物延伸产物的3'末端核苷酸特异性结合。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述聚合物分子是多糖聚合物。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述多糖聚合物包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖或其组合。
4.根据权利要求2或3所述的组合物，其中所述多糖聚合物是直链或支链的。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的组合物，其中所述多糖聚合物包含5-10000个单体。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的组合物，其中所述多糖聚合物是均聚物。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的组合物，其中所述多糖聚合物是β-葡聚糖或α-葡聚糖。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述多糖聚合物选自由右旋糖苷、淀粉、糖原、支链淀粉、纤维素、热凝多糖、海带多糖、地衣聚糖和酵母聚糖组成的群组。
9.根据权利要求2所述的组合物，其中所述多糖聚合物是右旋糖苷。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述底物分子与所述聚合物分子共价结合。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述多个底物分子选自吖啶酯、萤光素、鲁米诺、腔肠素、异鲁米诺、2,2'-叠氮基双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐(ABTS)、邻苯二胺二盐酸盐(OPD)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、其衍生物或其组合。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中，所述聚底物包含单一种类的所述底物分子。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述底物分子是荧光素、鲁米诺、异鲁米诺或腔肠素。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中，所述聚底物包含五(5)个或更多个底物分子，并且所述五个或更多个底物分子可以是单一种类或不止一个种类。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述结合部分是识别所述引物延伸产物的3'末端核苷酸中的所述碱基、所述糖、可裂解的保护基团或这些组分的组合的亲和试剂。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述亲和试剂是抗体、确定剂、适体或结蛋白。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述结合部分结合dNTP类似物的亲和标记配体。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述dNTP类似物包含将所述亲和标记配体连接至核碱基的可裂解的接头。
19.根据权利要求17的组合物，其中所述亲和标记配体是生物素、亲和素、链霉亲和素或抗原。
20.根据权利要求17的组合物，其中所述结合部分是生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素或抗原或抗体。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含发光酶。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述发光酶是辣根过氧化物酶或荧光素酶。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述荧光素酶是快速动力学荧光素酶或发光动力学荧光素酶。
24.根据权利要求22所述的组合物，其中所述荧光素酶是萤火虫荧光素酶或细菌荧光素酶。
25.一种检测dNTP类似物在引物延伸产物的3'末端的掺入的方法，其包括：
(a)使用DNA聚合酶在所述引物延伸产物的3'末端掺入dNTP类似物，从而产生引物延伸产物的3'末端核苷酸，
(b)使聚底物与所述引物延伸产物的3'末端核苷酸缔合以形成标记的引物延伸产物，其中，所述聚底物包含：
(i)聚合物分子，
(ii)附着于所述聚合物分子的多个底物分子，和
(iii)附着于所述聚合物分子的结合部分，
其中所述底物分子是发光酶底物；并且
其中所述结合部分特异性结合至：
(i)所述标记的引物延伸产物的所述3'末端核苷酸，或
(ii)第二结合部分，并且所述第二结合部分特异性结合所述标记的引物延伸产物的所述3'末端核苷酸；
(c)组合所述标记的引物延伸产物和至少一种发光酶；以及
(d)检测由所述发光酶作用于所述标记的引物延伸产物而产生的信号，
从而检测所述dNTP类似物在所述引物延伸产物的3'末端的掺入。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述引物延伸产物被固定在DNA阵列上。
27.根据权利要求25所述的方法，其中将所述引物延伸产物退火至固定在DNA阵列上的模板核酸。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述dNTP类似物是可逆终止子核苷酸。
29.根据权利要求25至28中任一项所述的方法，其中，
步骤(a)包括使用DNA聚合酶在固定于DNA阵列上的多个不同引物延伸产物的3'末端掺入多个不同种类的dNTP类似物，从而产生引物延伸产物的多个3'末端核苷酸，其中所述多个不同种类的dNTP类似物包括与腺苷杂交的dNTP类似物；与胸腺嘧啶和/或尿嘧啶杂交的dNTP类似物；与胞苷杂交的dNTP类似物以及与鸟苷杂交的dNTP类似物；
步骤(b)包括缔合至少两个聚底物分子种类，每个聚底物分子种类包括：
(i)聚合物分子，
(ii)附着于所述聚合物分子的多个底物分子，以及
(iii)附着于所述聚合物分子的结合部分，
其中每个种类包含可区分的底物分子组，并且每个种类包含对(1)单一种类的掺入的dNTP类似物或(2)特异性结合单一种类的掺入的dNTP类似物的初级亲和试剂具有特异性的结合部分，以及
其中在步骤(d)中，所述发光酶对单独标记的引物延伸产物的作用产生信号，该信号识别在所述引物延伸产物的所述3'末端掺入的dNTP类似物的种类。
30.根据权利要求29所述的方法，其中将不同的dNTP类似物同时与所述DNA阵列接触。
31.根据权利要求29所述的方法，其中将不同的dNTP类似物依次与所述DNA阵列接触。
32.根据权利要求25至31中任一项所述的方法，其中所述dNTP类似物包含未修饰的核碱基。
33.根据权利要求25至32中任一项所述的方法，其中所述结合部分是抗体。
34.根据权利要求25至33中任一项所述的方法，其中所述结合部分是与初级亲和试剂结合的二级亲和试剂，所述初级亲和试剂特异性结合所述标记的引物延伸产物的3'末端核苷酸。
35.根据权利要求25至34中任一项所述的方法，其中所述dNTP类似物包含亲和标记配体，并且所述结合部分包含亲和标记抗配体。
36.根据权利要求25至35中任一项所述的方法，其中，所述聚底物包括五(5)个或更多个底物分子，并且所述五个或更多个底物分子能够为单一种类或不止一个种类。
37.根据权利要求25至36中任一项所述的方法，其中，所述底物分子选自由萤光素、鲁米诺、腔肠素、异鲁米诺、吖啶酯、2,2'-叠氮基双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐(ABTS)、邻苯二胺二盐酸盐(OPD)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、其衍生物或其组合组成的群组。
38.根据权利要求25至37中任一项所述的方法，其中，所述聚底物包含单一种类的所述底物分子。
39.根据权利要求25至38中任一项所述的方法，其中所述底物分子是荧光素、鲁米诺、异鲁米诺或腔肠素。
40.根据权利要求25至39中任一项所述的方法，其中，所述结合部分是识别所述引物延伸产物的所述3'末端核苷酸中的所述碱基、所述糖、可裂解的保护基团或这些组分的组合的亲和试剂。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述亲和试剂是抗体、确定剂、适体或结蛋白。
42.根据权利要求25至41中任一项所述的方法，其中所述组合包括孵育所述标记的引物延伸产物和所...
【专利技术属性】
技术研发人员：拉多吉·德尔马纳茨，陈艳，李汉东，斯尼泽纳·德尔马纳茨，蒂莫西·朱，
申请(专利权)人：深圳华大智造科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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