一种RNA化学修饰的单基因单碱基分辨率检测方法技术

提供了一种检测RNA目标位点X的化学修饰的方法，其包括：(1)获得RNA样品，在RNA样品中选择包含RNA目标位点X的目标RNA区段；(2)SELECT步骤；(3)PCR扩增步骤；(4)将所述PCR阈值循环数与PCR阈值循环数参比值比较，或者将所述PCR扩增产物量与PCR扩增产物量参比值比较，以确定目标RNA位点X是否存在目标化学修饰。还提供了一种鉴定RNA修饰酶或RNA去修饰酶底物靶位点的方法和一种用于定量转录本中RNA修饰率的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种RNA化学修饰的单基因单碱基分辨率检测方法
本公开涉及分子生物学领域，具体涉及一种RNA化学修饰的单基因单碱基分辨率检测方法。
技术介绍
在生命的三个领域即细菌、古生菌、真核生物中发现了超过100种RNA的化学修饰。表观转录组标记N6-甲基腺苷(m6A)是真核mRNA和长非编码RNA(lncRNA)中最丰富的转录后RNA修饰。这些标记通常由m6A修饰酶(Writer)形成，已经鉴定出人类m6A修饰酶(甲基转移酶复合物)的几个亚单位：METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429和RBM15(RNA结合基序蛋白15)，并且位于MAT2A发夹和剪接体U6snRNA中的m6A由METTL16引入。m6A被称为去修饰酶的AlkB家族双加氧酶(例如人的FTO和ALKBH5)去除。m6A结合蛋白可以读取m6A标记。已知m6A标记会影响RNA加工和代谢，包括前体mRNA剪接、出核、mRNA稳定性和翻译。因此，m6A标记在许多生物学过程如干细胞分化、昼夜节律、紫外线诱导的DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测RNA目标位点X的化学修饰的方法，其包括：/n(1)获得RNA样品，在RNA样品中选择包含RNA目标位点X的目标RNA区段；/n(2)SELECT步骤：在目标RNA区段内、在RNA目标位点X的上游和下游分别设计上游探针Px1和下游探针Px2，利用所述下游探针Px2通过DNA聚合酶进行延伸，并用连接酶连接上游探针Px1和延伸后的下游探针Px2，得到SELECT产物；/n其中，上游探针Px1与目标RNA位点X的上游互补配对，且上游探针Px1 5’末端的第一个核苷酸和位于目标RNA位点X上游与目标RNA位点X距离1nt的核苷酸互补配对；/n下游探针Px2与目标RNA位点X的下游互补配对，且下...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】一种检测RNA目标位点X的化学修饰的方法，其包括：
(1)获得RNA样品，在RNA样品中选择包含RNA目标位点X的目标RNA区段；
(2)SELECT步骤：在目标RNA区段内、在RNA目标位点X的上游和下游分别设计上游探针Px1和下游探针Px2，利用所述下游探针Px2通过DNA聚合酶进行延伸，并用连接酶连接上游探针Px1和延伸后的下游探针Px2，得到SELECT产物；
其中，上游探针Px1与目标RNA位点X的上游互补配对，且上游探针Px15’末端的第一个核苷酸和位于目标RNA位点X上游与目标RNA位点X距离1nt的核苷酸互补配对；
下游探针Px2与目标RNA位点X的下游互补配对，且下游探针Px23’末端的第一个核苷酸和位于目标RNA位点X下游与目标RNA位点X距离1、2、3、4、5、6、7、8、9或10nt的核苷酸互补配对；
优选地，上游探针Px1与目标RNA位点X的上游互补配对的序列长度为15-30nt；下游探针Px2与目标RNA位点X的上游互补配对的序列长度为15-30nt；
(3)PCR扩增步骤：将步骤(2)获得的SELECT产物进行PCR扩增，确定PCR阈值循环数或PCR扩增产物量，优选通过qPCR荧光信号确定PCR阈值循环数，或优选通过聚丙烯酰胺凝胶电泳确定PCR扩增产物量；和
(4)将所述PCR阈值循环数与PCR阈值循环数参比值比较，或者将所述PCR扩增产物量与PCR扩增产物量参比值比较，以确定目标RNA位点X是否存在目标化学修饰。


根据权利要求1所述的方法，其中，所述化学修饰选自m
6A修饰、m
1A修饰、假尿苷修饰和2'-O-甲基化修饰。



根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述DNA聚合酶选自Bst2.0DNA聚合酶或TthDNA聚合酶，优选Bst2.0DNA聚合酶；所述连接酶选自SplintR连接酶、T3DNA连接酶、T4RNA连接酶2、T4DNA连接酶，优选SplintR连接酶或T3DNA连接酶。


根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤(4)中，所述PCR阈值循环数参比值是PCR阈值循环数第一参比值或者PCR阈值循环数第二参比值，其中：
所述PCR阈值循环数第一参比值为：
通过与所述目标RNA区段相同的方法确定的第一参比序列的PCR阈值循环数，所述第一参比序列至少包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列II具有与所述目标RNA区段中的核苷酸序列I相同的核苷酸序列，其中：核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与X位点的上游引物3’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与X位点的下游引物5’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列，且所述第一参比序列中与所述目标RNA区段的所述RNA目标位点X相对应的RNA目标位点X1不存在目标修饰；或者
其中，所述PCR阈值循环数第二参比值为：
通过与所述目标RNA区段相同的方法确定的第二参比序列的PCR阈值循环数，所述第二参比序列至少包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列II具有与所述目标RNA区段中的核苷酸序列I相同的核苷酸序列，其中：核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与X位点的上游引物3’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与X位点的下游引物5’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列，且所述第二参比序列中与所述目标RNA区段的所述RNA目标位点X相对应的RNA目标位点X2存在目标修饰。


根据权利要求4所述的方法，其中：
当所述PCR阈值循环数大于PCR阈值循环数第一参比值时，则确定所述RNA目标位点X存在目标化学修饰；或者
当所述PCR阈值循环数等于PCR阈值循环数第二参比值时，则确定所述RNA目标位点X存在目标化学修饰。


根据权利要求5所述的方法，其中，当所述PCR阈值循环数与PCR阈值循环数第一参比值多至少0.4-10个循环，优选至少0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10个循环时，则确定所述RNA目标位点X存在目标化学修饰。


根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，在步骤(4)中，所述PCR扩增产物量参比值是PCR扩增产物量第一参比值或者PCR扩增产物量第二参比值，其中：
所述PCR扩增产物量第一参比值为：
通过与所述目标RNA区段相同的方法确定的第一参比序列的PCR扩增产物量，所述第一参比序列至少包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列II具有与所述目标RNA区段中的核苷酸序列I相同的核苷酸序列，其中：核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与X位点的上游探针Px13’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与X位点的下游探针Px25’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列，且所述第一参比序列中与所述目标RNA区段的所述RNA目标位点X相对应的RNA目标位点X1不存在目标修饰；或者
其中，所述PCR扩增产物量第二参比值为：
通过与所述目标RNA区段相同的方法确定的第二参比序列的PCR扩增产物量，所述第二参比序列至少包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列II具有与所述目标RNA区段中的核苷酸序列I相同的核苷酸序列，其中：核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与X位点的上游探针Px13’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与X位点的下游探针Px25’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列，且所述第二参比序列中与所述目标RNA区段的所述RNA目标位点X相对应的RNA目标位点X2存在目标修饰。


根据权利要求7所述的方法，其中：
当所述PCR扩增产物量小于PCR扩增产物量第一参比值时，则确定所述RNA目标位点X存在目标化学修饰；或者
当所述PCR扩增产物量等于PCR扩增产物量第二参比值时，则确定所述RNA目标位点X存在目标化学修饰。


根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：
(c)控制初始RNA输入量：在所述目标RNA区段内，任选一个RNA非目标位点N，优选地，所述RNA非目标位点N位于所述RNA目标位点X的上游6nt至下游2nt处；在所述RNA非目标位点N的上游和下游分别设计上游探针Pn1和下游探针Pn2，利用所述下游探针Pn2通过DNA聚合酶进行延伸，并用连接酶连接上游探针Pn1和延伸后的下游探针Pn2，得到SELECT产物；
将SELECT产物进行PCR扩增，确定PCR阈值循环数；
根据PCR阈值循环数控制初始RNA输入量，使目标RNA区段与第一参比序列或第二参比序列的初始RNA输入量相等；
其中，所述第一参比序列至少包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列II具有与所述目标RNA区段中的核苷酸序列I相同的核苷酸序列，其中：当N位点位于X位点上游时，核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与N位点的上游探针Pn13’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与X位点的下游探针Px25’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列；当N位点位于X位点下游时，核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与X位点的上游探针Px13’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与N位点下游探针Pn25’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列；且所述第一参比序列中与所述目...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾桂芳，肖雨，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11