一种高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌、生产苯乳酸的方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌，所述基因工程菌的构建方法为：通过基因工程与代谢工程技术对地衣芽孢杆菌TCCC 11148(2709)或/大肠杆菌Rosetta(DE3)进行改造，包括抑制分支酸向色氨酸途径分支、抑制预苯酸向酪氨酸途径分支、过表达苯乳酸合成酶/氨基转移酶三步分子操作。本发明专利技术通过改造地衣芽孢杆菌芳香族氨基酸代谢途径，敲除苯乳酸合成前体苯丙氨酸合成途径竞争性酶基因，过表达苯乳酸合成最直接前体酶乳酸脱氢酶基因，大大提升苯乳酸产量，为获取目标产物苯乳酸提供了新的思路。最终，获得的苯乳酸生产菌株经发酵后产量达17.8g/L，在苯乳酸的工业化生产中具有一定潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌、生产苯乳酸的方法和应用
本专利技术属于基因
，尤其是一种高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌、生产苯乳酸的方法和应用。
技术介绍
苯乳酸(phenyllacticacid,PLA)，也称为2-羟基-3-苯基丙酸，分子式为C9H10O3。在天然环境中，苯乳酸多产于蜂蜜与奶酪中，制备后为浅黄色粉末，是一种具有优秀溶解度的小分子物质。现有技术合成苯乳酸主要是化学合成方法与生物合成方法，生物合成可以由多种微生物代谢获得，其中最主要的是通过乳酸菌发酵产生。苯乳酸因其具有抑菌谱广、稳定性高、亲水性强等多种优点，而被广泛应用于食品药品防腐剂中，作为饲料添加剂也可替代家畜饲料中的抗生素，具有较好的工业应用前景。苯乳酸的化学制备方法是利用水解、开环、结晶等过程合成获得目的产物，因为其存在着合成步骤繁杂、特异性差、副产物较多、分离纯化困难、耗能大、产生的污染物较多等问题，所以近几年的研究主要围绕微生物发酵和全细胞催化等生物合成技术生产苯乳酸。微生物发酵法主要是通过接种产苯乳酸菌株至液体培养基中，经过长时间发酵本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌的构建方法为：通过基因工程与代谢工程技术对地衣芽孢杆菌TCCC 11148或/大肠杆菌Rosetta(DE3)进行改造，包括抑制分支酸向色氨酸途径分支、抑制预苯酸向酪氨酸途径分支、过表达苯乳酸合成酶/氨基转移酶三步分子操作。/n

【技术特征摘要】
1.一种高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌的构建方法为：通过基因工程与代谢工程技术对地衣芽孢杆菌TCCC11148或/大肠杆菌Rosetta(DE3)进行改造，包括抑制分支酸向色氨酸途径分支、抑制预苯酸向酪氨酸途径分支、过表达苯乳酸合成酶/氨基转移酶三步分子操作。


2.根据权利要求1所述的高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌的构建方法的步骤如下：
⑴以地衣芽孢杆菌TCCC11148为出发菌株，敲除色氨酸合成途径中的邻氨基苯甲酸合成酶基因trpE；
⑵对地衣芽孢杆菌TCCC11148ΔtrpE进行敲除酪氨酸合成途径中的T-预苯酸脱氢酶基因tyrA；
⑶过表达地衣芽孢杆菌TCCC11148ΔtrpEΔtyrA乳酸脱氢酶基因ldh，即得高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌。


3.根据权利要求2所述的高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于：具体步骤如下：
⑴邻氨基苯甲酸合成酶基因trpE的敲除
①以GenBank编号CP033218的地衣芽孢杆菌TCCC11148基因组为模板，根据其trpE基因序列，分别在基因两端设计上游同源臂引物SEQNO.1、SEQNO.2和下游同源臂引物SEQNO.3、SEQNO.4，通过PrimeSTARMaxDNAPolymerase酶经过PCR扩增获得trpE的上、下游同源臂；
②将上、下游同源臂与经过线性化载体pKSVT(T2)通过solutionI混合连接酶连接获得敲除载体，化转入E.coliEC135中，提质粒再化转入E.coliEC135pM.Bam进行甲基化修饰，涂布含有卡那霉素和壮观霉素的LB平板37℃、12h，挑取转化子于5mL的LB试管中，37℃、220r/min培养至OD600为0.2时，加入质量终浓度为0.2％的阿拉伯糖进行诱导，30℃、220r/min培养12h，提取质粒电转化入地衣芽孢杆菌TCCC11148感受态，涂布含有卡那霉素的LB平板；
③将电转涂布的平板培养45℃、12h，筛选单交换的菌株划线至无抗性平板中培养37℃、12h，挑取生长菌株对点含有卡那霉素与不含抗生素的平板，筛选出在卡那霉素抗性平板不长、在无抗平板生长的菌株为双交换邻氨基苯甲酸合成酶基因trpE敲除菌株地衣芽孢杆菌TCCC11148ΔtrpE，并使用验证引物trpE1、trpE2对敲除菌株进行验证；
⑵T-预苯酸脱氢酶基因tyrA的敲除
①以地衣芽孢杆菌TCCC11148基因组为模板，根据其tyrA基因序列，分别在基因两端设计上游同源臂引物SEQNO.5、SEQNO.6和下游同源臂引物SEQNO.7、SEQNO.8，通过PrimeSTARMaxDNAPolymerase酶PCR扩增获得tyrA的上、下游同源臂；
②敲除载体的构建同⑴的步骤①，将获得的载体电转化至地衣芽孢杆菌TCCC11148ΔtrpE感受态中，涂布含有卡那霉素的LB平板；
③筛选双交换菌株方法同⑴的步骤③，筛选出双交换T-预苯酸脱氢酶基因tyrA的敲除菌株地衣芽孢杆菌TCCC11148ΔtrpEΔtyrA，并使用验证引物tyrASEQNO.11、SEQNO.12对敲除菌株进行验证；
⑶过表达乳酸脱氢酶基因ldh
①以植物...

【专利技术属性】
技术研发人员：张会图，关莹，王海宽，路福平，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12