一种猪霍乱沙门氏菌、疫苗及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种猪霍乱沙门氏菌C500(pVAX‑S/GnRH‑2a/KISS1‑asd)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2020055。该菌种应用于制备控制动物发情表现的药品或疫苗。本发明专利技术还公开了两种质粒，即pVAX‑S/GnRH‑asd质粒和pVAX‑S/GnRH‑2a/KISS1‑asd质粒，也可应用于制备控制动物发情表现的药品或疫苗。本发明专利技术还公开了一种控制动物发情表现的基因疫苗及其制备方法。该疫苗对动物进行免疫后产生腺激素释放激素和吻素的抗体，中和动物内源性激素，降低动物的攻击性，缓解动物躁动不安，食欲减退，异常兴奋的发情期问题。

【技术实现步骤摘要】
一种猪霍乱沙门氏菌、疫苗及其应用
本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种猪霍乱沙门氏菌、疫苗及其应用。
技术介绍
在自然情况下，动物的繁殖行为受激素水平及环境等因素的多重调控，但在生产和生活中往往需要人为的干扰和调控动物的行为及性状。在畜牧业生产上，尤其是大型家畜在发情期，由于激素水平的骤然改变，其性情往往也会发生巨大变化，这种由于发情带来的躁动、吼叫、撕咬、示威、打斗等现象，对于动物自身及其群体，或者直接接触发情动物的人员都是一种风险，甚至导致伤亡。每年由于宠物或饲养动物伤人的事件屡见不鲜，此外，群体养殖动物的打斗往往会给养殖场带来极大的经济损失。目前，就动物发情期难于饲养和管理的问题，国内已有一些相应的解决方法，借助去势控制动物的性行为，使其性情更加温顺，便于饲养管理。宠物行业的发展及动物福利的完善也推动了控制动物发情技术的创新和进步，同时也对相关技术的安全性提出了更高的要求。去势的方法主要包括手术去势、化学去势、免疫去势，但目前运用最为普遍的依旧是传统的手术去势法。手术去势法通常是指借助外力直接摘除睾丸和附睾，或者不进行摘除，而使用其他方式使睾丸失血和组织坏死，进而脱落。手术去势法虽然可以控制动物的发情表现，但在注射麻药和手术等过程中，都会给动物造成的强烈的应激反应，短期内可能引起去势动物的生长性能降低，另外还可能存在术后感染的风险、大家畜和野生动物不便操作等缺点。免疫去势通过对动物注射特定的外源生殖激素，诱导机体产生出能够中和该激素的特异性抗体，从而达到人为的改变生殖轴调节功能的目的，免疫去势法操作简单，且具有减小对动物体的损害、避免手术的疼痛和感染风险、以及不显著降低动物的生产性能的特点。因其独特的优势，在畜牧业和生活中也开始被广泛的研究和应用，免疫去势主要是选择下丘脑-垂体-性腺轴(Hypothalamic-pituitary-gonadalaxis,HPG)上的一种或多种生殖激素作为靶标，常见的如卵泡刺激素(FSH)、促黄体激素(LH)、促性腺激素释放激素(GnRH)、吻素(KISS1)以及其他与生殖相关的激素或受体。促性腺激素释放激素(GnRH)能够刺激促黄体素和卵泡刺激素释放到外周血液，进而调节性腺激素的合成，促进卵泡的发育和排卵，还能调节精子的发生以及第二性征的维持。但是研究表明GnRH的调节方式具有双重性，合适剂量的GnRH可以促进LH和FSH的分泌和释放，但当给予大剂量的外源GnRH或者GnRH的类似物时，反而抑制了机体的生殖系统功能。GnRH免疫疫苗的研究广泛，但也存在一些需要改进和解决的问题，比如GnRH疫苗免疫后的动物并未完全丧失繁殖能力、往往需要多次加强免疫、免疫时的剂量不易掌控等。KISS1又称吻素基因，能够编码145个氨基酸的神经肽前体,经剪切生成54个氨基酸的活性多肽,称为kisspeptin-54，其能够进一步裂解形成kisspeptin-10、13、14。研究发现KISS1能够调控下丘脑GnRH神经元分泌GnRH的活动，KISS1基因合成的kisspeptin神经肽与受体结合后能够控制GnRH的合成与分泌，从而改变LH和FSH的释放，达到调节动物的生殖生理活动的目的。实验表明KISS1作为免疫去势的新靶标具有良好的免疫效果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种工程菌猪霍乱沙门氏菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)以及其应用。本专利技术的另一目的在于提供两种质粒pVAX-S/GnRH-asd质粒和pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd质粒以及其应用。本专利技术的又一目的在于提供一种控制动物发情表现的基因疫苗以及其制备方法。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：猪霍乱沙门氏菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为：武汉大学，保藏日期为：2020年03月19日，保藏号为CCTCCNO:M2020055。分类命名是猪霍乱沙门氏菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)或SalmonellacholeraesuisC500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)。上述猪霍乱沙门氏菌，用作动物药品或疫苗。更进一步地，上述猪霍乱沙门氏菌，在制备控制动物发情表现的药品或疫苗中的应用。更进一步地，上述猪霍乱沙门氏菌，用于降低雄性梅花鹿发情期攻击性。上述工程菌可以制备GnRH-KISS1双表达DNA疫苗工程菌；通过SDS碱裂法进行质粒抽提，可以获取GnRH-KISS1的共表达质粒。将含有GnRH-KISS1双表达DNA疫苗的工程菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)直接免疫梅花鹿，能够达到有效抑制雄鹿的攻击性的目的，并缓解其躁动不安，食欲减退，异常兴奋等问题。减少了雄鹿群发情期因争“鹿王”和角斗引发的伤亡情况，也保障了饲养人员的安全，且不影响雄鹿第二年春季的正常生茸。一种控制动物发情表现的基因疫苗，包括上述猪霍乱沙门氏菌。该基因疫苗为GnRH-KISS1双表达DNA疫苗，包括GnRH基因和KISS1基因。pVAX-S/GnRH-asd质粒，其特征在于：包含S/GnRH基因，S/GnRH基因序列如SEQIDNO.1所示。pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd质粒，其特征在于：包含S/GnRH基因和KISS1基因，S/GnRH基因序列如SEQIDNO.1所示，KISS1基因序列如SEQIDNO.2所示。更进一步地，连接S/GnRH基因和KISS1基因的2A肽基因序列如SEQIDNO.3所示。上述两种质粒，在制备控制动物发情表现的药品或疫苗中的应用。一种控制动物发情表现的基因疫苗的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、人工合成GnRH基因和KISS1基因，GnRH基因上游串联乙肝表面抗原S基因，KISS1基因上游串联2A肽基因；S2、将含pVAX-asd质粒的沙门氏菌C500(pVAX-asd)和含pUC-S/GnRH-Amp的菌株活化培养，进行质粒提取；S3、将质粒pVAX-asd和pUC-S/GnRH-Amp进行NheI和HindIII双酶切，连接目的片段获得质粒pVAX-S/GnRH-asd；S4、将质粒pVAX-S/GnRH-asd和pUC-2a/KISS1-Amp进行HindIII和XhoI双酶切，连接目的片段获得质粒pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd；S5、将质粒pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd导入猪霍乱沙门氏菌C500菌株中，构建猪霍乱沙门氏菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)；S6、猪霍乱沙门氏菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)用于基因疫苗。本专利技术的有益效果在于：1、pVAX-S/GnRH-asd质粒能表达促性腺激素释放激素基因，调本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.猪霍乱沙门氏菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2020055。/n

【技术特征摘要】
1.猪霍乱沙门氏菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2020055。


2.权利要求1所述猪霍乱沙门氏菌，用作动物药品或疫苗。


3.权利要求2所述猪霍乱沙门氏菌，在制备控制动物发情表现的药品或疫苗中的应用。


4.权利要求3所述猪霍乱沙门氏菌，用于降低雄性梅花鹿发情期攻击性。


5.一种控制动物发情表现的基因疫苗，其特征在于：包括权利要求1所述猪霍乱沙门氏菌。


6.pVAX-S/GnRH-asd质粒，其特征在于：包含S/GnRH基因，S/GnRH基因序列如SEQIDNO.1所示。


7.pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd质粒，其特征在于：包含S/GnRH基因和KISS1基因，S/GnRH基因序列如SEQIDNO.1所示，KISS1基因序列如SEQIDNO.2所示。


8.根据权利要求7所述质粒，其特征在于：连接S/GnRH基因和KISS1基因的2A肽基因序列如SEQIDNO.3所示。


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【专利技术属性】
技术研发人员：熊家军，许学林，黎平贵，陈建国，杨艾平，杨波，荆焕松，胡映红，李可可，游思，
申请(专利权)人：华中农业大学，武汉金三鑫鹿业有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42