工程化细鞘丝藻及其生产GLA的应用制造技术

本发明专利技术涉及细鞘丝藻在生产GLA上的应用；还涉及一种工程化的细鞘丝藻，所述细鞘丝藻中，desB基因被敲除，并且转入desD基因过表达盒；还涉及一种生产GLA的方法，包括培养上述细鞘丝藻，并使所述细鞘丝藻生产GLA的步骤；还涉及一种desB基因，编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:3所示。本发明专利技术的工程化细鞘丝藻能够开放式大规模培养。在开放式半连续培养中，藻株具有良好的生物质产率和GLA产率(平均生物质产率为19.1±4.9g·m

【技术实现步骤摘要】
工程化细鞘丝藻及其生产GLA的应用
本专利技术涉及微藻合成生物学领域，更特别地，涉及一种工程化的细鞘丝藻及其应用，以及一种新的desB基因。
技术介绍
多不饱和脂肪酸(PolyunsaturatedFattyAcid，PUFA)是指含有两个或两个以上双键且碳长度为18-22个碳原子的直链脂肪酸，主要包括亚油酸(LA)、γ-亚麻酸(GLA)、α-亚麻酸(ALA)、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等。在PUFA中，距羧基端最远的双键在第3个碳原子上则称为ω-3(n-3)系列，如在第6个碳原子上则称为ω-6(n-6)系列。γ-亚麻酸(γ-linolenicacid，GLA)为ω-6系列多不饱和脂肪酸，是人体的必需脂肪酸，参与到多种代谢途径和组织结构中，它在人体组织中存在时间很短，且含量很少。正常人从食物中摄取的亚油酸(linoleicacid，LA)经Δ-6脱氢酶化为GLA，进而代谢为二高-γ-亚麻酸(doom-γ-Linolenicacid，DGLA)，再转变成前列腺素E1(PGE1)，或经Δ-5脱氢酶转化为花生四烯酸(arachidonicacid，ARA)生成其它前列腺素(PGS)。但当人体摄取过量的饱和脂肪酸或出现脂肪酸代谢紊乱时，Δ-6脱氢酶受到抑制，则影响亚油酸向GLA的转化，可造成体内前列腺素缺乏，导致多种疾病产生。此时，需要及时补充GLA来防止或治疗相应的疾病。因此，GLA可在抗炎、降血脂、抗肿瘤、改善糖尿病并发症、防治高血压和动脉粥样硬化、抗心脑血管疾病等方面起重要作用。目前，在一些高等植物、蓝藻和异养微生物中均发现有GLA的存在。如高等植物的月见草(OenotherabiennisL1)种子中油脂含量为15-25％，其中GLA占7-11.22％；玻璃苣(BoragoofficinalisL1)种子中的油脂含量20-30％，其中GLA占15-25％；蓝藻中节旋藻(Arthrospirasp.；过去称为螺旋藻，Spirulinasp.)的GLA的含量可占细胞总脂的8％-25％，曾有报道在一株钝顶节旋藻中，GLA可占细胞干重的2％(Roughan,1989)；在真菌的被孢霉属(Mortierellaramannianavar)中GLA一般可占细胞总脂的10％左右，深黄被孢霉(Mortierellaisabellina)中GLA占细胞总脂的3％-11％，何东平等通过诱变技术得到一种深黄被孢霉的突变株，突变株中GLA可占总脂的8.5-10.3％。目前GLA在工业上的生产主要是利用真菌的发酵来进行，如日本学者铃木修利用被孢霉发酵产GLA，发酵150h后,GLA的产量最高达到2.9g·L-1，GLA产率为0.464g·L-1·d-1；邢来君等人利用200L发酵罐内发酵培养96h，最终可获得1.34g·L-1的GLA，GLA产率为0.335g·L-1·d-1。但是利用真菌发酵生产GLA需要昂贵的发酵设备及添加葡萄糖等碳源，生产成本高，而且真菌来源的GLA往往含有其异构体(ALA)，需要进一步纯化，加大了生产成本。节旋藻是目前少数可以进行户外规模化养殖的微藻，相比发酵生产，其成本更低，可以进行光合自养，无须额外补充碳源，但是节旋藻适宜养殖温度在30℃左右，一般在25-35℃之间，温度过高(40℃)或者过低(20℃以下)均不能正常生长(特别是冬季低温和夏季高温条件下)。此外，有研究表明温度过高后者过低均显著降低节旋藻中GLA含量的。细鞘丝藻(Leptolyngbyasp.)也可以进行规模化养殖，并且比节旋藻生长更快，温度适应范围更宽，尤其是在40℃生长良好，对于夏季户外培养棚中的高温条件有较好的适应能力。细鞘丝藻的另一个突出优点是可以通过接合转移进行遗传操作。但是，细鞘丝藻本身可以合成ALA而不是GLA，因此，我们希望通过基因工程的手段对细鞘丝藻的脂肪酸合成途径进行改造，一方面阻断ALA合成，另一方面过量表达合成GLA的基因，获得能生产GLA的细鞘丝藻工程藻株。
技术实现思路
为解决以上问题，本专利技术通过对细鞘丝藻进行了遗传操作，使其不能合成ALA，转而合成GLA。基于以上工作，本专利技术提供了细鞘丝藻在生产GLA上的应用。本专利技术还提供了一种工程化的细鞘丝藻，所述细鞘丝藻中，desB基因被敲除，并且转入desD基因过表达盒。在一个优选实施方案中，所述desD基因过表达盒含有强启动子和desD基因编码序列。在一个具体是实施方案中，所述desD基因编码序列如SEQIDNO:1所示。在一个具体实施方案中，所用的强启动子为在细鞘丝藻中可组成型强表达或可诱导强表达的启动子，例如，psbA、rbcL和cpcB等基因的启动子。也可以将这些启动子组合使用。在一个优选实施方案中，所述desD基因过表达盒插入到所述desB基因内，使所述desB基因被敲除。尽管列举该方案作为一个优选方案，但是本专利技术的范围不限于此，任何将desB基因敲除同时过表达desD基因的方法均落在本专利技术的保护范围内。在一个具体实施方案中，用于工程化的原始藻株为具有ALA合成路径的细鞘丝藻，例如，Leptolyngbyasp.BL0902，并且desB基因的序列如SEQIDNO:2所示。在一个具体实施方案中，上述用于生产GLA的细鞘丝藻藻株为2020年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号CCTCCM2020087的藻株。本专利技术还提供了一种生产GLA的方法，包括培养上述细鞘丝藻，并使所述细鞘丝藻生产GLA的步骤。在一个具体实施方案中，所述细鞘丝藻的培养温度为20-40℃。本专利技术还提供了一种△15脂肪酸脱饱和酶编码基因，编码的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。在一个具体实施方案中，所述的△15脂肪酸脱饱和酶编码基因的核酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术的工程化细鞘丝藻能够开放式大规模培养。在开放式半连续培养中，藻株具有良好的生物质产率和GLA产率(平均生物质产率为19.1±4.9g·m-2·d-1，平均GLA产率为0.35±0.07g·m-2·d-1)。此外，本专利技术的工程化细鞘丝藻不生产ALA，省去了分离GLA与ALA工序，降低了纯化难度和成本。生物材料保藏我们已于2020年4月28日将一株可产生GLA不产生ALA的细鞘丝藻保藏于中国湖北省武汉市武汉大学的中国中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCM2020087。该藻株的分类学命名为：细鞘丝藻PpsbA-desDLeptolyngbyasp.PpsbA-desD。附图说明图1为运载质粒pHB6127的图谱；图2为细鞘丝藻desD过表达株PpsbA-desD的基因组结构示意图；图3为细鞘丝藻PpsbA-desD和野生型的GC图谱；图4为不同温度下培养的细鞘丝藻PpsbA-desD的GLA含量(％细胞干重)；图5为细鞘丝藻PpsbA-desD在跑道池中半连本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.细鞘丝藻在生产GLA上的应用。/n

【技术特征摘要】
1.细鞘丝藻在生产GLA上的应用。


2.一种工程化的细鞘丝藻，其特征在于，所述细鞘丝藻中，desB基因被敲除，并且转入desD基因过表达盒。


3.根据权利要求2所述的细鞘丝藻，其特征在于，所述desD基因过表达盒含有强启动子和desD基因编码序列。


4.根据权利要求3所述的细鞘丝藻，其特征在于，所述desD基因编码序列如SEQIDNO:1所示。


5.根据权利要求3所述的细鞘丝藻，其特征在于，所述强启动子为psbA启动子、rbcL启动子、cpcB启动子中的一种或多种组合。


6.根据权利要求2所述的细鞘丝藻，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐旭东，高宏，王雅丽，孔任秋，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42