成像测定法制造技术

本申请涉及用于检测液体样品、优选生物样品中的分析物分子的测定法和系统。特别地，本发明专利技术涉及一种确定液体样品中目标分析物的存在的方法，该方法包括使样品与包含对目标分析物具有特异性的分析物结合域的第一邻位探针接触并孵育，其中第一邻位探针通过改变所观察到的性质的聚合物或生物聚合物栓链分子被栓系于固体支持物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】成像测定法本申请涉及用于检测液体样品、优选生物样品中的分析物分子的测定法和系统。基于抗体的分析技术是流行的且众所周知的分析技术，其已在生物化学和医学中广泛用于定性和定量检测液体样品中的分析物。最常见的基于抗体的测定法类型是酶联免疫吸附测定法或“ELISA”。已知多种不同的ELISA技术，所有这些从根本上都依赖于酶标记的抗体与抗原的特异性结合。由于抗体-抗原相互作用的高度特异性，ELISA技术以其高灵敏度和低浓度检测抗原的能力而闻名。这种灵敏度导致ELISA被广泛用于诸如检测血清样品中抗体的存在以确定患者是否存在某种疾病；分析食物样品以确定是否存在过敏原；毒理学筛查；以及检测表明存在特定类型肿瘤的生物标志物(例如蛋白质)等应用中。虽然如此，仍希望进一步提高基于ELISA的技术的灵敏度，以便提高其在疾病的早期诊断中的效用。在疾病的非常早期阶段，体液样品中存在的生物标志物的水平可能低于当前测定技术的检测水平(LOD)，因此可能无法检测到此类生物标志物，或者只能检测到低水平，而不允许做出确信的诊断。在一些非早期阶段疾病的情况下，也可能存在低水平的生物标志物，从而引起相同的检测和诊断问题。但是，希望能够尽可能早地且尽可能确信地做出诊断，特别是在诸如癌症、神经退行性疾病和感染等疾病的情况下，其中通过早期检测和治疗可以显著改善预后。例如，体积为约1mm3的早期癌症小肿瘤通常由大约100万个细胞组成。成年人平均血液量约为5升。假设肿瘤中的每个细胞向5升循环血液分泌约5000个蛋白质分子作为癌症生物标志物，则血液中癌症生物标志物分子的浓度大约为2×10-15moldm-3(即大约2飞摩尔)。这低于许多当前测定技术的灵敏度，如ELISA或表面等离子共振(灵敏度通常约为pM–nM级)。LOD可以正式定义为当信号外推至背景水平时(分析物浓度为零时)的分析物浓度，加上背景水平的3个标准偏差。为了获得较低的LOD，很明显，必须同时降低背景水平及其变化。LOD也可以定义为与信号水平相对应的浓度，该信号水平是空白样品的平均信号水平加上3乘以空白样品的标准偏差。定义如下所示，其中“f”是将原始信号电平转换为浓度的校准函数。使用含有已知浓度的目标分析物的标准溶液通过实验确定校准函数。LOD＝f(空白平均值+3×空白标准偏差)近来，基于ELISA的技术已被引入市场，其被广告宣传为具有飞摩尔级或亚飞摩尔级的LOD。例如，可从QuanterixCorporation(Lexington，Massachusetts，USA)获得的“Simoa”测定法和仪器广告宣传的LOD为亚飞摩尔级。可从Singulex,Inc.(Alameda，California，USA)获得的SMCTM/测定技术广告宣传的LOD也为亚飞摩尔级。然而，这些技术仍然具有希望克服的缺点。例如，“Simoa”技术具有有限的动态范围，并且在高于约10-14M的分析物浓度下不能给出定量结果。“SMC”/”Erenna”技术检测与抗原分离的单个扩散的荧光团标记的报告抗体。抗体-抗原结合的化学计量的变化、抗体粘附在反应室中以及扩散分子的固有随机性为使用这些技术检测到的抗原定量带来了很大的不确定性。Simoa技术和SMC/Erenna技术均采用昂贵的大型仪器(～1.5–3m3)，需要很大的实验室空间。此外，尽管ELISA方案通常使用封闭缓冲液旨在防止报告抗体与固体支持物的非特异性结合这一事实，但即使在诸如Simoa、SMC或Erenna分析测定法等高灵敏度测定法中也将不可避免地发生一定程度的非特异性结合。这种非特异性结合产生了背景信号，该背景信号与从特异性结合至目标分析物的抗体获得的信号无法区分。这些背景信号限制了LOD，并限制了常规的基于ELISA的技术准确定量分析物浓度的能力。限制基于ELISA的技术尤其是在医学诊断领域中的适用性的另一个因素是所需的样品的体积可能为约毫升级。如果待分析的样品是体液样品(例如血液或脑脊髓液样品)，则可能需要从患者身上抽取较大体积的量，这可能是不愉快的经历。因此，希望开发需要较少样品体积的测定技术。常规的基于ELISA的技术的另一个特点是进行测定和分析结果所花费的时间通常在2-3小时或更长时间内。因此，希望开发具有少于1小时运行时间的测定技术。这不仅将提高进行大批量样品分析的周转率，而且还将为采用基于ELISA的测定法进行名副其实的即时检测开辟道路。作为基于荧光的测定法的替代方法，使用光散射的测量也已用于检测生物分子的存在。例如干涉散射显微镜检查(iSCAT)是一种光学显微镜技术，它依赖于照射散射物体并收集由散射物体散射的光场与参考光场之间的干涉，该干涉是由在散射物体所在位置附近的界面处照射的反射所提供的。在没有散射物体的情况下，在相机上检测到的光场纯粹来自于反射光场。在存在散射物体的情况下，反射光的强度由于来自物体的散射光与反射光之间的干涉而衰减。iSCAT已被应用到许多生物分子检测应用中，其中生物分子的质量足够大，以至于自身无法产生足够强的散射光场，或者其中生物分子被质量更高的纳米颗粒标记。本申请专利技术人现已出乎意料地发现，本专利技术的测定法能够区分报告抗体的特异性结合和非特异性结合，从而改善LOD至10-15M或更低的典型水平，并且在至少一些情况下可实现10-18M或更低的水平。可以在10μl或更少的样品体积上进行本专利技术的测定法，该样品体积与通过“扎手指”皮肤穿刺法获得的血液样品的体积相配。本专利技术的测定法能够以高精确度定量分析物的分子数量，甚至是在样品体积中仅存在几十个分析物分子时。本专利技术的测定法的运行时间通常小于1小时。
技术实现思路
本专利技术涉及单独标志物分子的成像，以及使用栓链分子(tethermolecule)将单个标志物连接至固体支持物。栓链分子足够长，以使通过栓链连接的材料相对于不经栓链非特异性连接至表面的材料具有不同的特征，如运动范围和运动速度。因此，可以将正确拴系的材料与不是通过栓链固定或未被固定的潜在较高水平的背景信号区分开。本申请专利技术人已出乎意料地发现，通过将第一邻位探针(proximityprobe)栓系于支持物，使得第一邻位探针和支持物之间存在空间间隔关系，可以区分背景或“假阳性”信号与由第一邻位探针和溶液中荧光标记的产物之间的相互作用产生的真实信号。由于栓链的长度，与仅随机粘附在表面上的分子相比，通过栓链连接的荧光探针似乎具有更大的运动面积(即更大的扩散)。因此，本专利技术提供了一种确定液体样品中目标分析物的存在的方法，该方法包括以下步骤：(i)将样品与包含对目标分析物具有特异性的分析物结合域的第一邻位探针接触并孵育，其中第一邻位探针通过聚合物或生物聚合物栓链分子被栓系于固体支持物，从而使所述目标分析物栓系于支持物；(ii)对被栓系的目标分析物具有特异性的单独分子生成信号；和(iii)通过观察固体支持物上信号的运动来检测被栓系的目标分析物。该测定法检测来自连接于单独栓链的分子的信号及其运动。尽管任选地可以将多于一种目标分析物连接于每个栓链，并且每种目标分析物可以选择性地本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种确定液体样品中目标分析物的存在的方法，其包括以下步骤：/n(i)使样品与第一邻位探针接触并孵育，所述第一邻位探针包含对目标分析物具有特异性的分析物结合域，其中所述第一邻位探针通过聚合物栓链分子或生物聚合物栓链分子被栓系于固体支持物，从而将所述目标分析物栓系于所述支持物；/n(ii)由对被拴系的目标分析物具有特异性的单独分子生成信号；和/n(iii)通过观察所述信号在所述固体支持物上的运动来检测被栓系的目标分析物。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180504 GB 1807409.61.一种确定液体样品中目标分析物的存在的方法，其包括以下步骤：
(i)使样品与第一邻位探针接触并孵育，所述第一邻位探针包含对目标分析物具有特异性的分析物结合域，其中所述第一邻位探针通过聚合物栓链分子或生物聚合物栓链分子被栓系于固体支持物，从而将所述目标分析物栓系于所述支持物；
(ii)由对被拴系的目标分析物具有特异性的单独分子生成信号；和
(iii)通过观察所述信号在所述固体支持物上的运动来检测被栓系的目标分析物。


2.根据权利要求1所述的确定液体样品中目标分析物的存在的方法，其中所述信号是荧光。


3.根据权利要求2所述的确定液体样品中目标分析物的存在的方法，其中使用全内反射荧光显微法来照射样品和检测所述目标分析物。


4.根据权利要求1所述的确定液体样品中目标分析物的存在的方法，其中所述信号是光散射。


5.根据任一项前述权利要求所述的确定液体样品中目标分析物的存在的方法，其包括以下步骤：
(i)使样品与第一邻位探针接触并孵育，所述第一邻位探针包含对所述目标分析物具有特异性的分析物结合域，其中所述第一邻位探针通过聚合物栓链分子或生物聚合物栓链分子被栓系于固体支持物；
(ii)使样品与第二邻位探针接触并孵育，所述第二邻位探针包含对所述目标分析物具有特异性的分析物结合域，其中
a.所述第二邻位探针包含荧光团；或
b.所述第二邻位探针在接触样品之前与报告酶缀合；或
c.所述第二邻位探针在接触样品的同时或之后与报告酶缀合；或
d.所述第二邻位探针包含用于荧光原位杂交(FISH)的寡核苷酸序列；或
e.所述第二邻位探针包含纳米颗粒，所述纳米颗粒生成待鉴定的可测量信号；
(iii)a.如果所述第二邻位探针与报告酶缀合，则向样品中添加所述报告酶的荧光底物以生成荧光反应产物；或
b.如果所述第二邻位探针包含用于荧光原位杂交(FISH)的寡核苷酸序列，则使所述第二邻位探针与FISH探针杂交，所述FISH探针包含荧光团和与所述第二邻位探针的寡核苷酸序列互补的寡核苷酸序列；
(iv)照射样品以使荧光团或荧光反应产物发荧光或使纳米颗粒散射光；并且
(v)通过观察来自荧光团或荧光反应产物或纳米颗粒的荧光或散射信号的运动来检测所述目标分析物。


6.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述第一邻位探针包括以下或由以下组成：抗体、凝集素、可溶性细胞表面受体、来自噬菌体展示或核糖体展示的组合衍生的蛋白质、碳水化合物、适体、affimer、亲合体、affilin、affitin、α体、anticalin、avimer、DARPin、寡核苷酸、多核苷酸、单功能抗体，或它们的组合。


7.根据任一项前述权利要求所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·D·钱德拉多斯，景博，李梦秋，
申请(专利权)人：牛津纳米成像有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB