用于识别样本中的病原体的荧光测定和用于执行这种测定的计算机实现的系统技术方案

本申请公开了一种使用荧光成像系统识别和表征样本中的完整病原体的方法，特别是用于表征细菌和病毒的方法，以及用于实现该方法的相关联的系统和部件套件。该方法包括将样本与来自以下类别中的至少两种的荧光探针一起培养：用于结合病原体表面碳水化合物的荧光探针；核酸染色剂；和膜染色剂。然后使用荧光成像设备对样本成像以检测候选对象，并且候选对象的荧光特性用于识别对象是否是病原体，并且如果是，则识别病原体的类型。特别优选的实施方式采用流动来改善数据采集，并采用机器学习分类算法来区分不同的病原体类型。类算法来区分不同的病原体类型。类算法来区分不同的病原体类型。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于识别样本中的病原体的荧光测定和用于执行这种测定的计算机实现的系统


[0001]本专利技术涉及通过荧光显微镜法检测和识别病原体的方法，特别是以最少的样本制备快速识别体液中完整病毒和细菌的方法。本专利技术还涉及用于执行这种方法的部件套件和计算机实现的系统。

技术介绍

[0002]检测体液中病原体的既定方法是(等温)PCR以检测基因组物质，通过抗体或适体检测来自病原体的抗原，或检测间接指示病原体存在的针对抗原的人类抗体。这些方法输出易于解释的一维数据点，所述数据点通常指示样本中存在的病原体组分的数量。然而，基于这些方法的诊断测试仅对一种类型的病原体敏感，花费数小时运行，遭受假阴性和假阳性问题，不敏感，和/或由于使用难以制造的试剂(如酶和抗体)而导致成本高。
[0003]还已知使用显微镜来识别病原体，但是现有技术受到许多限制。
[0004]例如，传统的基于显微镜的检测方法只能拾取大的病原体(尺寸大于1μm)并且灵敏度低，通常需要存在高病原体浓度，或在成像之前培养病原体。此外，即使对于要有效成像的足够尺寸的病原体，这些技术通常也限于区分广泛类别的病原体(例如，革兰氏阳性与革兰氏阴性)，而不能表征这些类别内的病原体，诸如特定种类的病原体。
[0005]基于荧光的技术也是已知的，其使用对特定标记特异的荧光标记分子(诸如抗体或适体)，来检测给定病原体上的特定标记。然而，虽然这些技术有利于识别样本中是否存在特定病原体类型，但它们不太适合于检查样本的一系列病原体类型的广泛测试。特别地，在样本中引入和区分多种不同类型的荧光标记的抗体/适体是不切实际且昂贵的。此外，该方法通常不能识别新的病原体形式，针对这些新的病原体形式的特异性结合分子尚未被开发。
[0006]作为用于检测病原体的基于荧光的方法的示例，WO 2020/089621描述了通过用多价阳离子处理病毒，然后添加带负电荷的聚合物，用带负电荷的聚合物(特别是多核苷酸)来功能化病毒粒子的方法。作者描述了将病毒粒子固定到基底上，然后用病毒特异性识别剂(例如，毒株特异性抗体、适体或互补基因组探针)标记的可能性。识别剂和可选的聚合物用可检测的标记物(诸如荧光团)标记，以允许通过单分子显微镜检测它们。
[0007]Shiaelis等报道的最近的工作描述了使用具有短荧光DNA的相同阳离子介导的病毒粒子功能化作为识别病毒的手段，而不使用病毒特异性识别剂。在这项工作中，使用氯化锶用绿色和红色荧光DNA的混合物标记传染性支气管炎病毒(IBV)和三种不同的流感病毒株(Udorn、X31、PR8)，并使用全内反射(TIRF)显微镜将其固定在载玻片上用于单分子成像。检查所得荧光图像的共定位荧光信号(显示绿色荧光和红色荧光两者的斑点)，并使用卷积神经网络算法对这些共定位信号进行进一步分析。
[0008]电子显微镜可以检测最小的病原体，但是样本制备复杂且耗时，并且仅取样少量的材料。这使得该技术不适合于快速诊断应用。
[0009]COVID
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19大流行凸显了对病原体检测方法的需求尚未得到满足，该方法能够可靠、快速且简单地检测出容易获得的体液样本(诸如唾液、鼻液、呼吸或尿液)中的多种病原体，并具有识别新病原体类型的潜力。

技术实现思路

[0010]鉴于前述内容，本专利技术人开发了通用且快速的方法，用于通过荧光显微镜，使用容易获得的非特异性试剂，以最少的样本制备，从体液样本中检测和识别完整病原体。
[0011]具体地，在第一方面，本专利技术提供了一种使用荧光成像系统来识别样本中的病原体的方法，所述荧光成像系统被配置为用激发光源照射样本，并检测多个颜色通道中产生的荧光，所述方法包括：(1)标记步骤，包括将样本与来自以下类别中的至少两种的荧光探针一起培养：(a)用于与病原体表面碳水化合物结合的荧光探针；(b)核酸染色剂；(c)膜染色剂；其中，每个类别的荧光探针在荧光成像系统的所述多个颜色通道中的一个不同颜色通道中是能检测的；(2)成像步骤，包括使用荧光成像系统对样本成像，以产生所述多个颜色通道中的每个颜色通道的荧光图像数据；(3)测量步骤，包括检测荧光图像数据中显示高于阈值的荧光的候选对象的存在，并将每个候选对象的所述多个颜色通道中的信号(优选地，信号强度)记录为样本数据；以及(4)表征步骤，包括分析样本数据以生成结果数据，其中，结果数据包括候选对象是否是病原体，如果是，则结果数据包括病原体的类型。
[0012]该技术基于以下事实：每种病原体类型将在其表面碳水化合物、核酸材料和膜材料的特征方面变化，当用(a)、(b)和(c)型荧光探针标记病原体时，这些特征将影响检测到的总荧光信号。例如，不同的病原体类型将在其表面处的碳水化合物的类型和量方面变化，包括那些碳水化合物的确切加工状态(例如，由于下面描述的原因，病原体表面加工不足的低聚甘露糖的量)，这将影响与病原体表面结合的探针(a)的量。类似地，不同的病原体类型将在其遗传物质的性质(RNA对DNA，单链对双链)、存在的核酸的量、该核酸材料对荧光标记的可及性(受任何包封膜或衣壳层的性质、材料的包装、核蛋白等的影响)方面变化，这些都将导致与那些病原体结合的探针(b)的量的差异。同样，不同的病原体将在膜的范围(通常与病原体的大小相关)和其膜的组成(例如，在胆固醇或神经节苷脂的量和分布方面)方面变化，这将影响与膜结合的探针(c)的量。除了影响探针的结合之外，例如由于量子产率的变化(例如，当与RNA而不是DNA结合时，探针(b)可能具有更高的量子产率，并且探针(c)可能在不同的膜环境中显示不同的量子产率)或福斯特共振能量转移(FRET)，给定病原体的结构和组成特性也可能导致探针(a)
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(c)的荧光行为的差异。考虑到这多重因素，从用(a)
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(c)中的至少两种[最优选地(a)
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(c)中的全部]标记的病原体测量的荧光信号用作高度独特的“签名”，本专利技术利用该签名来识别病原体类型。该技术广泛适用于病原体，而不管类型
如何，并且甚至能够用于识别和表征先前未知的病原体。
[0013]该方法应与现有技术形成对比，现有技术基于靶向给定病原体的特异性标志物特征的荧光探针(例如使用抗体或核酸特异性探针)，来识别病原体。在这种情况下，该技术简单地基于信号是否存在来识别病原体。然而，这种方法是不经济的，并且不能实际地扩展到用于识别不同病原体的广泛诊断测试中。特别地，能够使用的不同探针的范围必然受到区分不同荧光团的能力的限制。此外，这种方法不适于识别新的病原体类型，针对这些病原体类型的靶向探针尚未被开发。
[0014]本专利技术的方法还应与Shiaelis等人教导的技术形成对比，该技术依赖于非特异性荧光DNA探针通过阳离子介导的机制与病毒膜的结合。Shiaelis技术仅探测病毒膜，因此不能利用通过将关于膜的信息与关于病原体其他部分的信息组合而获得的大量额外信息，这必然限制了该方法的准确性和可扩展性。此外，DNA与膜之间相互作用的性质很少被表征，这意味着荧光特性不能容易地与病本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种使用荧光成像系统来识别样本中的病原体的方法，所述荧光成像系统被配置为用激发光源照射所述样本并检测多个颜色通道中产生的荧光，所述方法包括：(1)标记步骤，包括将样本与来自以下类别中的至少两种的荧光探针一起培养：(a)用于与病原体表面碳水化合物结合的荧光探针；(b)核酸染色剂；(c)膜染色剂；其中，每个类别的荧光探针在所述荧光成像系统的所述多个颜色通道中的一个不同颜色通道中是能检测的；(2)成像步骤，包括使用所述荧光成像系统对所述样本成像，以产生所述多个颜色通道中的每个颜色通道的荧光图像数据；(3)测量步骤，包括检测所述荧光图像数据中显示高于阈值的荧光的候选对象的存在，并将每个候选对象的所述多个颜色通道中的信号记录为样本数据；(4)表征步骤，包括分析所述样本数据以生成结果数据，其中，所述结果数据包括所述候选对象是否是病原体，如果是，则所述结果数据包括病原体的类型。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述成像是宽场成像。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述标记步骤包括将所述样本与荧光探针(a)以及荧光探针(b)或(c)中的至少一种一起培养。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述标记步骤包括将所述样本与所有荧光探针(a)、(b)和(c)一起培养。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述标记步骤包括将所述样本与靶向不同病原体表面碳水化合物的类别(a)中的多个荧光探针一起培养，其中，所有探针(a)、(b)和(c)在所述荧光成像系统的所述多个颜色通道中的一个不同颜色通道中是能检测的。6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述荧光探针(a)是荧光标记的凝集素，或根据权利要求5所述的方法，其中，每个荧光探针(a)是荧光标记的凝集素。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述样本在所述成像步骤期间流动。8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述荧光成像系统包括：物镜，具有相关联的对焦体积和透镜中心轴，流体通道，沿着所述透镜中心轴延伸穿过焦平面；所述激发光源，用于照射所述对焦体积；以及相机，用于检测在所述多个颜色通道中由所述物镜从所述对焦体积收集的荧光；并且其中，所述样本在所述成像步骤期间垂直地流过所述焦平面。9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述激发光源产生在所述物镜的焦平面处并平行于所述物镜的焦平面横向照射的光片，优选地，其中，所述光片的厚度大于或等于所述流体通道的横截面。10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述成像步骤包括在不同激发波长之间交替所述激发光源。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述成像步骤包括同时检测各个颜色通道中的荧光。12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述成像步骤包括在不同激发波长之间交替所
述激发光源，并在单独的预定检测器区域上同时检测所述不同颜色通道中的荧光发射。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述表征步骤包括将所述样本数据输入到机器学习分类算法中。14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述机器学习分类算法输出候选对象可能对应的每种可能的病原体类型的分类概率。15.根据权利要求14所述的方法，其中，如果满足一个或多个预定阈值标准，则所述机器学习分类算法将特定病原体类型分配给候选对象。16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述预定阈值标准是所述候选对象是该病原体类型的概率至少为0.4，并且该概率比下一个领先类别大至少1.5倍。17.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：牛津纳米成像有限公司，
类型：发明
国别省市：