【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】增强干细胞向β细胞分化的方法交叉引用本申请要求于2018年3月2日提交的美国临时申请号62/637,923的权益，该临时申请通过引用全文并入本文。
技术介绍
破译指导胰岛细胞再生、适应性和功能的分子机制可改善和拓展治疗糖尿病的β细胞替代策略。干细胞衍生的β细胞的生成可以为胰岛和胰腺器官的生成提供可能有用的步骤。可以由干细胞衍生组织治疗的快速生长的疾病之一是糖尿病。1型糖尿病由胰岛中β细胞的自身免疫破坏而导致。2型糖尿病由外周组织胰岛素抗性和β细胞功能障碍而导致。糖尿病患者，尤其是患有1型糖尿病的患者，可以通过移植新的β细胞而治愈。通过这一举措，可以使移植了尸体的人胰岛的患者在5年或更长时间内不依赖于胰岛素，但是由于供体胰岛的缺乏和质量问题，这种方法是有限的。从干细胞生成无限的人β细胞供应可以将这种疗法扩展到数百万新患者，并且可以成为将干细胞生物学转化到临床中的重要测试案例。援引并入说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同具体地和个别地指出要通过引用来并入每一个出版物、专利或专利申请。除非另有说明，否则本说明书中提及的出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文。
技术实现思路
在一些方面，本文提供了一种方法，其包括：将胰腺祖细胞或其前体的群体与表观遗传修饰化合物接触，其中与未接触所述表观遗传修饰化合物的相应内分泌细胞群体相比，所述接触导致内分泌细胞群体中嗜铬粒蛋白A阳性(CHGA+)细胞或C肽阳性和NKX6.1阳性(C-PEP+、NKX6.1+)细胞的比例增加。
【技术保护点】
1.一种方法，其包括：/n将胰腺祖细胞或其前体的群体与表观遗传修饰化合物接触，其中与未接触所述表观遗传修饰化合物的相应内分泌细胞群体相比，所述接触导致内分泌细胞群体中嗜铬粒蛋白A阳性(CHGA+)细胞或C肽阳性和NKX6.1阳性(C-PEP+、NKX6.1+)细胞的比例增加。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180302 US 62/637,9231.一种方法，其包括：
将胰腺祖细胞或其前体的群体与表观遗传修饰化合物接触，其中与未接触所述表观遗传修饰化合物的相应内分泌细胞群体相比，所述接触导致内分泌细胞群体中嗜铬粒蛋白A阳性(CHGA+)细胞或C肽阳性和NKX6.1阳性(C-PEP+、NKX6.1+)细胞的比例增加。
2.一种方法，其包括：
将胰腺祖细胞或其前体的群体与表观遗传修饰化合物接触，其中与未接触所述表观遗传修饰化合物的相应内分泌细胞群体相比，所述接触导致内分泌细胞群体中表达VMAT或Cdx2的细胞比例降低。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述表观遗传修饰化合物包括一种或多种DNA甲基化抑制剂、组蛋白乙酰转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂或溴结构域抑制剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述表观遗传修饰化合物包括组蛋白甲基转移酶抑制剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是EZH2抑制剂。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂选自DZNep、GSK126和EPZ6438。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。
8.根据权利要求7所述的方法，其中与所述胰腺祖细胞或其前体的群体接触的所述DZNep的浓度为约0.05μM至约50μM、约0.1μM至约10μM、约0.5μM至约5μM、约0.75μM至约2.5μM或约1μM至约2μM。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述DZNep的所述浓度为至少约0.5μM。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述DZNep的所述浓度为约1μM。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述表观遗传修饰化合物包括组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述HDAC抑制剂选自KD5170、MC1568和TMP195。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是KD5170。
15.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述表观遗传修饰化合物包括HDAC抑制剂和EZH2抑制剂。
16.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述表观遗传修饰化合物包括DZNep和KD5170。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述方法在体外进行。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其进一步包括使所述胰腺祖细胞或其前体的群体与选自以下的试剂接触：(i)SHH途径抑制剂，(ii)视黄酸(RA)信号传导途径激活剂，(iii)γ-分泌酶抑制剂，(iv)表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，(v)骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂，(vi)TGF-β信号传导途径抑制剂，(vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂，(viii)蛋白激酶抑制剂，以及(ix)ROCK抑制剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中：
(A)所述SHH途径抑制剂包括SANT1；
(B)所述RA信号传导途径激活剂包括视黄酸；
(C)所述γ-分泌酶抑制剂包括XXI；
(D)来自EGF家族的所述生长因子包括β-细胞素。
(E)所述BMP信号传导途径抑制剂包括LDN；
(F)所述TGF-β信号传导途径抑制剂包括Alk5iII；
(G)所述甲状腺激素信号传导途径激活剂包括GC-1；
(H)所述蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素；或者
(I)所述ROCK抑制剂包括thiazovinin。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其包括使所述胰腺祖细胞或其前体的群体与选自以下的试剂接触：β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5iII、GC-1、LDN和星形孢菌素。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述接触为至少三天。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述接触包括将所述胰腺祖细胞或其前体的群体与所述表观遗传修饰化合物接触超过三天的时间段，并且在所述时间段的前三天与所述胰腺祖细胞或其前体的群体接触之后，从所述EGF家族中去除所述SHH途径抑制剂、所述RA信号传导途径激活剂或所述生长因子。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述接触为至少五天。
24.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述接触为约七天。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述胰腺祖细胞群体中的至少一个细胞表达PDX1和NKX6-1中的至少一个。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述胰腺祖细胞群体中的至少一个细胞表达PDX1和NKX6-1。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述内分泌细胞群体中的至少一个细胞表达CHGA。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述内分泌细胞群体中的至少一个细胞表达C肽和NKX6.1。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述内分泌细胞群体包含的CHGA+细胞的比例比未接触所述表观遗传修饰化合物的相应内分泌细胞群体高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％、220％、250％、280％、300％、320％、350％、380％、400％、420％、450％、480％或500％，如通过流式细胞术测量。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述内分泌细胞群体包含的C-PEP+、NKX6.1+细胞的比例比未接触所述表观遗传修饰化合物的相应内分泌细胞群体高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％、220％、250％、280％、300％、320％、350％、380％、400％、420％、450％、480％或500％，如通过流式细胞术测量。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述内分泌细胞群体包含表达VMAT或Cdx2的细胞的比例比未接触所述至少一种表观遗传修饰化合物的相应内分泌细胞群体低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％、220％、250％、280％、300％、320％、350％、380％或400％，如通过流式细胞术测量。
32.通过权利要求1-31中任一项所述的方法产生的细胞。
33.一种包含细胞群体的组合物，其中所述细胞群体包含：
(a)至少约20％的表达C肽和NKX6.1的细胞；
(b)至少约60％的表达CHGA的细胞；
(c)至多约20％的表达Cdx2的细胞；或者
(d)至多约45％的表达VMAT1的细胞，如通过流式细胞术测量。
34.一种组合物，其包含细胞群体，所述细胞群体包含至少约30％的ISL1阳性、NKX6.1阳性细胞和至多约20％的ISL1阴性、NKX6.1阴性细胞，如通过流式细胞术测量。
35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述细胞群体包含至少约35％的ISL1阳性、NKX6.1阳性细胞。
36.根据权利要求34所述的组合物，其中所述细胞群体包含至少约40％的ISL1阳性、NKX6.1阳性细胞。
37.根据权利要求34-36中任一项所述的组合物，其中所述细胞群体包含至多约15％的ISL1阴性、NKX6.1阴性细胞。
38.根据权利要求33-37中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含：
(a)至少约20％的表达C肽和NKX6.1的细胞；
(b)至少约60％的表达CHGA的细胞；以及
(c)至多约20％的表达Cdx2的细胞，如通过流式细胞术测量。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述组合物包含至多约45％的表达VMAT1的细胞，如通过流式细胞术测量。
40.根据权利要求33-39中任一项所述的组合物，其进一步包含表观遗传修饰化合物。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述表观遗传修饰化合物包括一种或多种DNA甲基化抑制剂、组蛋白乙酰转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂或溴结构域抑制剂。
42.根据权利要求40所述的组合物，其中所述表观遗传修饰化合物包括组蛋白甲基转移酶抑制剂。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是EZH2抑制剂。
44.根据权利要求42或43所述的组合物，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂选自DZNep、GSK126和EPZ6438。
45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。
46.根据权利要求45所述的组合物，其中与所述胰腺祖细胞或其前体的群体接触的所述DZNep的浓度为约0.05μM至约50μM、约0.1μM至约10μM、约0.5μM至约5μM、约0.75μM至约2.5μM或约1μM至约2μM。
47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述DZNep的所述浓度为至少约0.5μM。
48.根据权利要求46所述的组合物，其中所述DZNep的所述浓度为约1μM。
49.根据权利要求40-48中任一项所述的组合物，其中所述表观遗传修饰化合物包括组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂。
50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。
51.根据权利要求50所述的组合物，其中所述HDAC抑制剂选自KD5170、MC1568和TMP195。
52.根据权利要求50所述的组合物，其中所述HDAC抑制剂是KD5170。
53.根据权利要求40所述的组合物，其中所述表观遗传修饰化合物包含HDAC抑制剂和EZH2抑制剂。
54.根据权利要求40所述的组合物，其中所述表观遗传修饰化合物包括DZNep和KD5170。
55.根据权利要求33-54中任一项所述的组合物，其还包含选自以下的试剂：(i)SHH途径抑制剂，(ii)视黄酸(RA)信号传导途径激活剂，(iii)γ-分泌酶抑制剂，(iv)表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，(v)骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂，(vi)TGF-β信号传导途径抑制剂，(vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂，(viii)蛋白激酶抑制剂，以及(ix)ROCK抑制剂。
56.根据权利要求55所述的组合物，其中：
(A)所述SHH途径抑制剂包括SANT1；
(B)所述RA信号传导途径激活剂包括视黄酸；
(C)所述γ-分泌酶抑制剂包括XXI；
(D)来自EGF家族的所述生长因子包括β-细胞素。
(E)所述BMP信号传导途径抑制剂包括LDN；
(F)所述TGF-β信号传导途径抑制剂包括Alk5iII；
(G)所述甲状腺激素信号传导途径激活剂包括GC-1；
(H)所述蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素；或者
(I)所述ROCK抑制剂包括thiazovinin。
57.根据权利要求55或56所述的组合物，其包含选自以下的试剂：β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5iII、GC-1、LDN和星形孢菌素。
58.一种组合物，其包含胰腺祖细胞和组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂或组蛋白甲基转移酶抑制剂中的至少一种。
59.根据权利要求58所述的组合物，其进一步包含内分泌细胞。
60.根据权利要求58或59所述的组合物，其中所述HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。
61.根据权利要求60所述的组合物，其中所述HDAC抑制剂选自KD5170、MC1568和TMP195。
62.根据权利要求61所述的组合物，其中所述HDAC抑制剂是KD5170。
63.根据权利要求62所述的组合物，其中所述组合物中所述KD5170的浓度为约0.05μM至约50μM、约0.1μM至约10μM、约0.5μM至约5μM、约0.75μM至约2.5μM或约1μM至约2μM。
64.根据权利要求63所述的组合物，其中所述KD5170的所述浓度为至少0.5μM。
65.根据权利要求64所述的组合物，其中所述KD5170的所述浓度为约1μM。
66.根据权利要求58-65中任一项所述的组合物，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是EZH2抑制剂。
67.根据权利要求66所述的组合物，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂选自DZNep、GSK126和EPZ6438。
68.根据权利要求67所述的组合物，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。
69.根据权利要求68所述的组合物，其中所述组合物中所述DZNep的浓度为约0.05μM至约50μM、约0.1μM至约10μM、约0.5μM至约5μM、约0.75μM至约2.5μM或约1μM至约2μM。
70.根据权利要求69所述的组合物，其中所述DZNep的所述浓度为至少0.5μM。
71.根据权利要求69所述的组合物，其中所述DZNep的所述浓度为约1μM。
72.根据权利要求58所述的组合物，其中所述HDAC抑制剂是KD5170，且所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。
73.根据权利要求58-72中任一项所述的组合物，其中所述组合物是体外组合物。
74.根据权利要求58-73中任一项所述的组合物，其还包含选自以下的试剂：(i)SHH途径抑制剂，(ii)视黄酸(RA)信号传导途径激活剂，(iii)γ-分泌酶抑制剂，(iv)表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，(v)骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂，(vi)TGF-β信号传导途径抑制剂，(vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂，(viii)蛋白激酶抑制剂，以及(ix)ROCK抑制剂。
75.根据权利要求74所述的组合物，其中：
(A)所述SHH途径抑制剂包括SANT1；
(B)所述RA信号传导途径激活剂包括视黄酸；
(C)所述γ-分泌酶抑制剂包括XXI；
(D)来自EGF家族的所述生长因子包括β-细胞素。
(E)所述BMP信号传导途径抑制剂包括LDN；
(F)所述TGF-β信号传导途径抑制剂包括Alk5iII；
(G)所述甲状腺激素信号传导途径激活剂包括GC-1；
(H)所述蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素；或者
(I)所述ROCK抑制剂包括thiazovinin。
76.根据权利要求74或75所述的组合物，其还包含选自以下的试剂：β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5iII、GC-1、LDN和星形孢菌素。
77.一种方法，其包括：
使包含胰腺祖细胞或其前体的细胞群体与组蛋白甲基转移酶抑制剂接触，并产生包含内分泌细胞的细胞群体；以及
使包含内分泌细胞的所述细胞群体成熟，以获得至少一种胰腺β细胞，所述胰腺β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
78.根据权利要求77所述的方法，其进一步包括使所述细胞群体与选自以下的试剂接触：(i)SHH途径抑制剂，(ii)视黄酸(RA)信号传导途径激活剂，(iii)γ-分泌酶抑制剂，(iv)表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，(v)骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂，(vi)TGF-β信号传导途径抑制剂，(vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂，(viii)蛋白激酶抑制剂，以及(ix)ROCK抑制剂。
79.根据权利要求78所述的方法，其中：
(A)所述SHH途径抑制剂包括SANT1；
(B)所述RA信号传导途径激活剂包括视黄酸；
(C)所述γ-分泌酶抑制剂包括XXI；
(D)来自EGF家族的所述生长因子包括β-细胞素。
(E)所述BMP信号传导途径抑制剂包括LDN；
(F)所述TGF-β信号传导途径抑制剂包括Alk5iII；
(G)所述甲状腺激素信号传导途径激活剂包括GC-1；
(H)所述蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素；或者
(I)所述ROCK抑制剂包括thiazovinin。
80.根据权利要求78或79所述的方法，其包括使所述细胞群体与选自以下的试剂接触：β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5iII、GC-1、LDN和星形孢菌素。
81.根据权利要求77-80中任一项所述的方法，其进一步包括使所述细胞群体与组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂接触。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是KD5170。
83.根据权利要求7...
【专利技术属性】
技术研发人员：费利西亚·帕柳卡，乔治·哈伯，马斯·居特勒，詹森·加利亚，柏叶军，莉莲·叶，奥斯汀·蒂尔，吉哈德·亚辛，埃夫雷特·汤普森，
申请(专利权)人：沃泰克斯药物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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