一种活化凝血因子XIIIA与巴曲酶BTX融合蛋白及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种活化凝血因子XIIIA与巴曲酶BTX融合蛋白及其构建方法与应用，融合蛋白包括通过将两个具有凝血活性的人活化凝血因子XIIIA和巴曲酶BTX分别连接到柔性肽linker的两端，通过融合表达得到FXIIIA‑BTX融合蛋白，其中人活化凝血因子XIIIA的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，巴曲酶BTX的DNA列如SEQ ID NO.2所示，柔性肽linker的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，FXIIIA‑BTX融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

【技术实现步骤摘要】
一种活化凝血因子XIIIA与巴曲酶BTX融合蛋白及其构建方法与应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种活化凝血因子XIIIA与巴曲酶BTX融合蛋白及其构建方法与应用。
技术介绍
凝血功能是指使血液由流动状态变成不能流动的凝胶状态的过程的一种能力。广义的凝血功能，除了机体在血管受损时所具有的由凝血因子按照一定顺序相继激活而生成凝血酶最终使纤维蛋白原变成纤维蛋白而促使血液凝固的能力外，还包括血小板的活性。凝血过程分为凝血酶原激活复合物的形成、凝血酶原的激活和纤维蛋白的生成三个基本步骤。在术前检测患者有无凝血功能的异常，可有效防止在术中及术后出现出血不止等意外。而抗血小板治疗过程中也要随时检测凝血功能，以评价疗效、预防出血风险等。因此，凝血功能检测是医院的常规项目，其中的血小板功能检测就用到由活化凝血因子XIIIA与巴曲酶复配而成的检测试剂盒，不同厂家有不同的名称，有的称为P1、P2、P3试剂，有的称为A、B、C试剂，用血栓弹力图仪(thrombelastographcoagulationanalyzer,TEG)进行检测。该法不需要对肝素抗凝的血样做其它特殊处理、不受肝素影响、30分钟即可出结果，很受市场欢迎。FXIII又称为纤维蛋白稳定因子(fibrinstabilizationfactor,FSF)，是构成稳定的纤维蛋白凝块所必需的凝血因子，同时也可促进细胞粘附和组织修复。FXIII在1948年由Laki和Lorand首先发现。FXIII是由2个A亚基和2个B亚基组成的A2B2四聚体，当发生出血后，激活后的凝血酶在Ca2+存在下迅速使ⅩⅢ激活，激活后的FXIII是失去2个B亚基和切除N端若干个氨基酸后的2个A亚基的二聚体(即FXIIIA)；在血浆中，FXIIIA催化互相接近的纤维蛋白单体交联形成网格状结构，首先使线性的γ链在邻近的肽链间形成桥键而快速交联，然后是较为缓慢的网状的α链的交联，使纤维蛋白凝块更致密而坚固,即使在5M尿素溶液中也不溶解，起到正常的止血作用。FXIIIA在本质上是转谷氨酰胺酶，它使肽链间赖氨酸残基上的ε氨基与谷氨酰胺残基上的γ酰胺基连结成新的肽键。每一纤维蛋白单体最多能形成6个共价桥键，若每分子内有2～3个，就可形成很稳定的交联纤维蛋白。FXIIIA另一个重要的作用底物为α2-纤溶酶抑制物，在FXIIIA的作用下，α2-纤溶酶抑制物以共价键交联于纤维蛋白原及纤维蛋白α链上,使后者免于纤溶酶降解。另外，FXIIIA在伤口愈合和维持妊娠中也发挥重要作用。巴曲酶在国内有两种同名不同质的产品。一种巴曲酶(Batroxobin，BTX)是WHO对毒蛇Bothropsatrox蛇毒中所含的纤维蛋白促凝蛋白酶所命名的通用名，具有促凝血特性，可用于止血。另一种是Bothropsmoojeni蛇毒所含的巴曲酶，具有去纤维蛋白原作用，可用于溶栓，多用于急性缺血性脑血管疾病、突发性耳聋等症的治疗。本专利技术特指的是具有促凝作用的第一种巴曲酶。国内外将活化的FXIIIA与BTX分别按照一定的比例混合，制备成检测血小板凝血功能的血小板检测试剂盒，称为P1或者A试剂。目前，FXIIIA主要由欧美的几家大公司生产和供应，价格高昂、供货周期长，给生产企业造成极大的成本负担。为了降低成本，生产企业往往通过增加相对廉价的国产BTX的用量达到与进口产品一致的检测指标，导致各个企业产品的FXIIIA与BTX比例不一致，同一企业也存在不同批次间产品的质量也难以达到一致，严重影响生产企业的盈利能力和产品质量的稳定性，为降低和简化P1或者A试剂盒的生产成本和配制流程，保证产品批次间的质量稳定性和检测的结果的特异性，本专利技术将FXIIIA与BTX进行融合表达设计，形成FXIIIA-BTX的二聚体蛋白质，它除了可用于研发检测凝血功能的体外诊断试剂盒外，也可以进一步用于开发凝血功能更强的止血药品、敷料等产品。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提供一种活化凝血因子XIIIA与巴曲酶BTX融合蛋白。本专利技术的第二目的是提供一种活化凝血因子XIIIA与巴曲酶BTX融合蛋白构建方法。本专利技术的第三目的是探讨活化凝血因子XIIIA与巴曲酶BTX融合蛋白在制备检测血小板凝血功能的体外诊断试剂盒、开发凝血功能更强的止血药品和敷料等产品中的应用。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种活化凝血因子XIIIA与巴曲酶BTX融合蛋白，所述融合蛋白包括通过将两个具有凝血活性的人活化凝血因子XIIIA和巴曲酶BTX分别连接到柔性肽linker的两端，通过融合表达得到FXIIIA-BTX融合蛋白，其中人活化凝血因子XIIIA的DNA序列如SEQIDNO.1所示，巴曲酶BTX的DNA列如SEQIDNO.2所示，柔性肽linker的DNA序列如SEQIDNO.3所示，FXIIIA-BTX融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。进一步，所述的一种活化凝血因子XIIIA与巴曲酶BTX融合蛋白构建方法，具体步骤如下：1)将编码活化的人活化凝血因子XIIIA的基因进行密码子优化设计，使其易于在大肠杆菌中高水平表达；2)将编码巴西矛头蛇的巴曲酶BTX基因进行密码子优化设计，使其易于在大肠杆菌中高水平表达；3)将步骤1)和步骤2)中编码的人活化凝血因子XIIIA和巴曲酶BTX的基因通过优化的柔性肽linker序列连接，使人活化凝血因子XIIIA和巴曲酶BTX的基因融合表达为一条FXIIIA-BTX多肽分子，得到FXIIIA-BTX融合基因；4)将步骤3)中的FXIIIA-BTX融合基因构建到大肠杆菌原核表达载体pCold-SUMO-10×His上,构建得到pCold-FXIIIA-BTX重组质粒；5)将步骤4)中的pCold-FXIIIA-BTX重组质粒进行诱导表达，得到FXIIIA-BTX融合蛋白。进一步，所述人凝血因子XIIIA的DNA序列如SEQIDNO.1所示，所述巴曲酶BTX的DNA列如SEQIDNO.2所示，柔性肽linker的DNA序列如SEQIDNO.3所示，所述FXIIIA-BTX融合基因的DNA序列如SEQIDNO.4所示，所述FXIIIA-BTX融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。进一步，所述FXIIIA-BTX融合基因的基因长度为3156nt。进一步，步骤5)中FXIIIA-BTX融合蛋白多肽自组装形成FXIIIA-BTX二聚体。进一步，所述FXIIIA-BTX融合蛋白在制备检测凝血功能的体外诊断试剂盒、凝血功能更强的止血药品、敷料等产品中的应用。由于采用了上述技术方案，本专利技术具有如下的优点：1、本专利技术在FXIIIA和BTX基因之间通过优化的linker序列连接得到的融合基因，进而优先在pCold-SUMO-10×His表达有活性的融合蛋白，该融合蛋白可以自动组装成二聚体，使得FXIIIA与BTX的活性分子的数量以1：2的形式固定下来，保证了产品批次间的质量和试剂含量的一致性；2、本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种活化凝血因子XIIIA与巴曲酶BTX融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括通过将两个具有凝血活性的人活化凝血因子XIIIA和巴曲酶BTX分别连接到柔性肽linker的两端，通过融合表达得到FXIIIA-BTX融合蛋白，其中人活化凝血因子XIIIA的DNA序列如SEQID NO.1所示，巴曲酶BTX的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，柔性肽linker的DNA序列如SEQ IDNO.3所示，FXIIIA-BTX融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种活化凝血因子XIIIA与巴曲酶BTX融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括通过将两个具有凝血活性的人活化凝血因子XIIIA和巴曲酶BTX分别连接到柔性肽linker的两端，通过融合表达得到FXIIIA-BTX融合蛋白，其中人活化凝血因子XIIIA的DNA序列如SEQIDNO.1所示，巴曲酶BTX的DNA序列如SEQIDNO.2所示，柔性肽linker的DNA序列如SEQIDNO.3所示，FXIIIA-BTX融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。


2.如权利要求1所述的一种活化凝血因子XIIIA与巴曲酶BTX融合蛋白构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)将编码活化的人凝血因子XIIIA的基因进行密码子优化设计，使其易于在大肠杆菌中高水平表达；
2)将编码巴西矛头蛇的巴曲酶BTX基因进行密码子优化设计，使其易于在大肠杆菌中高水平表达；
3)将步骤1)和步骤2)中编码的人活化凝血因子XIIIA和巴曲酶BTX的基因通过优化的柔性肽linker序列连接，使人活化凝血因子XIIIA和巴曲酶BTX的基因融合表达为一条FXIIIA-BTX多肽分子，得到FXIIIA-BTX融合基因；
4)将步骤3)中的FXIIIA-BTX融合基因构建到大肠杆菌原核表达载体pCold-SUM...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永平，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50