本发明专利技术提供了H‑NOX蛋白的多聚形式，其为与单体H‑NOX蛋白相比以较长循环半衰期输送氧的多聚H‑NOX蛋白。多聚H‑NOX蛋白渗出到肿瘤组织中和优先在肿瘤组织中积累，以持续输送氧。本发明专利技术还提供H‑NOX蛋白作为放射增敏剂用于脑癌治疗的应用。
【技术实现步骤摘要】
H-NOX蛋白的多聚形式相关申请本申请为2013年1月7日提交的、专利技术名称为“H-NOX蛋白的多聚形式”、申请号为201380074345.5的中国专利技术专利申请的分案申请。关于联邦赞助研究或研发的声明本专利技术得到批准号2R44CA138006-02的赞助。美国政府享有本申请的任何专利发行的权利。
本申请涉及多聚H-NOX蛋白和用其输送氧的方法。多聚H-NOX蛋白提供向人和以兽医为目的向动物输送O2的新治疗手段。专利技术背景H-NOX蛋白(命名血红素-一氧化氮和氧结合域)是高度保守的、被充分表征的血红素蛋白家族的成员(Iyer,LMetal.(2003)BMCGenomics4(1):5；Karow,DSetal.(2004)Biochemistry43(31):10203-10211；Boon,EMetal.(2005)NatureChem.Biol.1:53-59；Boon,EMetal.(2005)Curr.Opin.Chem.Biol.9(5):441-446；Boon,EMetal.(2005)J.Inorg.Biochem.99(4):892-902；Cary,SPetal.(2005)ProcNatlAcadSciUSA102(37):13064-9；KarowDSetal.(2005)Biochemistry44(49):16266-74；Cary,SPetal.(2006)TrendsBiochemSci31(4):231-9；Boon,EMetal.(2006)JBiolChem281(31):21892-902；Winger,JAetal.(2007)JBiolChem.282(2):897-907)。H-NOX蛋白是一氧化氮中性的，不同于之前的基于血红蛋白的氧载体，H-NOX不清除循环的一氧化氮，因此不与高血压或肾副作用有关。固有的低NO反应性(和高NO稳定性)致使野生型和突变H-NOX蛋白成为期望的血液替代品，因为H-NOX蛋白因内源NO而失活的可能性较低并且内源NO被H-NOX蛋白清除的可能性较低。重要地，一些H-NOX蛋白中远侧口袋(distalpocket)酪氨酸的存在(Pellicena,P.etal.(2004)ProcNatl.AcadSciUSA101(35):12854-12859)暗示了不期望的高NO反应性，不适用作血液替代品。例如，照此类推，结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)血红蛋白——具有在结构上相似的远侧口袋酪氨酸——与NO极快地反应，并且被分枝杆菌用来有效地清除和避免被感染宿主产生的防御性NO(Ouellet,H.etal.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA99(9):5902-5907)。然而，惊讶地发现，H-NOX蛋白实际上具有的NO反应性远低于血红蛋白，这使其可能用作血液替代品。发现通过引入单个氨基酸突变可使结合NO而不结合O2的H-NOX蛋白转化成结合NO和O2的H-NOX蛋白(参见WO2007/139791和WO2007/139767)。因此，可通过如下改变H-NOX蛋白对O2和NO的亲和力和H-NOX蛋白在O2和NO配体之间进行分辨的能力：引入一个或多个氨基酸突变，使得H-NOX蛋白经修饰以期望的亲和力结合O2或NO。可引入另外的突变来进一步改变O2和/或NO亲和力。H-NOX蛋白家族可因此被调控以呈现关于O2输送的提高的或最佳的动力学和热力学性质。例如，已生成O2结合的解离常数和/或解离率(offrate)改变的突变H-NOX蛋白，提高了H-NOX蛋白对于各种临床和工业应用的效用。调整H-NOX蛋白以结合和输送O2的能力是解决和克服当前O2载体的核心缺点的治疗手段。H-NOX蛋白的尺寸相对较小，并且可滤过肾脏，导致循环半衰期短。某些治疗用途需要具有较长循环半衰期的可足够长时间地结合并输送O2和/或NO至远侧组织的H-NOX。本文提供了具有较长循环半衰期的多聚H-NOX蛋白。另外，H-NOX蛋白渗出到肿瘤中，在此其以不同的速率积累。多聚H-NOX蛋白被调整以运输氧穿过肿瘤的常氧区域并在肿瘤内的低氧区域深处释放氧。这种特征组合代表氧载体作为肿瘤低氧生态位的修饰剂，增加放射治疗、化学治疗和依靠肿瘤细胞氧合的其他抗癌治疗的效力的应用中的重大进步。在此引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，其全部内容被引入本文作为参考。专利技术概述在一些方面，本专利技术提供多聚H-NOX蛋白，其包括两个或更多个H-NOX结构域。在一些实施方式中，两个或更多个H-NOX结构域是同源H-NOX结构域。在其他实施方式中，H-NOX结构域是异源H-NOX结构域。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白是二聚体、三聚体、四聚体或五聚体。在一些实施方式中，H-NOX结构域共价连接。在本专利技术的一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括单体，其中单体包括H-NOX结构域和聚合结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域共价连接至聚合结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域的C端共价连接至聚合结构域。在其他实施方式中，H-NOX结构域的N端共价连接至聚合结构域。在一些实施方式中，单体结合形成多聚H-NOX蛋白。在本专利技术的一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白是三聚H-NOX蛋白。在一些实施方式中，三聚H-NOX蛋白包括一个或多个三聚结构域。在一些实施方式中，三聚H-NOX蛋白包括三个单体，其中单体包括H-NOX结构域和三聚结构域。在一些实施方式中，三聚结构域是噬菌体T4三聚结构域。在一些实施方式中，三聚结构域是折叠子(foldon)结构域。在一些实施方式中，折叠子结构域包括SEQIDNO:4的氨基酸序列。在一些实施方式中，H-NOX结构域共价连接至三聚结构域。在一些实施方式中，H-NOX结构域的C端共价连接至三聚结构域的N端。在其他实施方式中，H-NOX结构域的N端共价连接至三聚结构域的N端。在上述任一种实施方式的一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白不包括鸟苷酰环化酶结构域。在上述实施方式的一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括至少一个标签。在一些实施方式中，多聚H-NOX蛋白包括至少一个His6标签。在上述任一种实施方式的一些实施方式中，氨基酸连接物位于H-NOX结构域和/或聚合结构域和/或标签之间。在一些实施方式中，氨基酸连接物是Gly-Ser-Gly序列或Arg-Gly-Ser序列。在上述任一种实施方式的一些实施方式中，H-NOX结构域中至少一个是腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobactertengcongensis)H-NOX结构域、嗜肺军团菌(L.pneumophilia)2H-NOX结构域、人类(Homosapiens)β1H-NOX结构域、狼(Canislupus)H-NOX结构域、褐鼠(Rattusnorvegicus)β1H-NOX结构域、黑腹果蝇(Drosophilamelangaster)β1H-NOX结构域、黑腹果蝇(D.melanga本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.多聚H-NOX蛋白，包括两个或更多个H-NOX结构域。/n
【技术特征摘要】
1.多聚H-NOX蛋白，包括两个或更多个H-NOX结构域。
2.重组H-NOX蛋白，包括H-NOX结构域和聚合结构域。
3.权利要求2所述的重组H-NOX蛋白，其中所述H-NOX结构域共价连接至所述聚合结构域。
4.权利要求2或3所述的重组H-NOX蛋白，其中所述H-NOX结构域的C端连接至所述聚合结构域。
5.权利要求2或3所述的重组H-NOX蛋白，其中所述H-NOX结构域的N端连接至所述聚合结构域。
6.权利要求2-5中任一项所述的重组H-NOX蛋白，其中所述H-NOX结构域连接至所述聚合结构域的N端。
7.权利要求2-5中任一项所述的重组H-NOX蛋白，其中所述H-NOX结构域连接至所述聚合结构域的C端。
8.输送O2至患脑癌个体的脑肿瘤的方法，包括给予所述个体有效量的H-NOX蛋白。
9.治疗患脑癌个体的脑癌的方法，包括
a)给予所述个体有效量的H-NOX蛋白，和
b)给予所述个体有效量的辐射。
10.减少患脑癌个体的脑肿瘤生长的方法，包括
a)给予所述个体有效量的H-NOX蛋白，和
b)给予所述个体有效量的辐射。
【专利技术属性】
技术研发人员：G·卡普，L·瑟沃，N·勒摩恩，S·P·L·卡里，
申请(专利权)人：欧姆尼奥克斯公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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