一种基于目标蛋白酶自身催化性质的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于目标蛋白酶自身催化性质的检测方法，属于蛋白酶检测技术领域,选取与藻体生长相关的碳酸酐酶、碱性磷酸酶为目标蛋白,设计新型结构的DNA纳米器件作为探针，并结合蛋白酶自身的催化反应，将酶催化产物转化为单链DNA，从而通过单链DNA的测定来实现蛋白酶的检测，包括对碳酸酐蛋白酶的测定方法以及对碱性磷酸蛋白酶的测定方法。该基于目标蛋白酶自身催化性质的检测方法，通过设计DNA纳米探针，并对其进行优化以得到纳米探针，为制备电化学生物传感器对藻体生长相关酶的量的测定奠定基础，通过将蛋白酶的检测转换为DNA的测定，并结合Toehold介导的无酶DNA循环放大策略，建立新型灵敏的电化学生物传感器，克服传统方法中灵敏度低的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种基于目标蛋白酶自身催化性质的检测方法
本专利技术属于蛋白酶检测
，具体为一种基于目标蛋白酶自身催化性质的检测方法。
技术介绍
随着工业和经济的飞速发展，水体污染问题日益突出。由于工业废水的肆意排放，导致80％以上的地表水、地下水被污染。据监测统计，中国达到三类水质可以进入自来水厂的最低要求的仅占29.5％，而劣五类水质却高达44％。另外，海域的形势也不容乐观，赤潮年年如期而至。近年来，各国越来越重视对水体污染物的治理。利用藻类的吸收、富集和降解作用去除污水中的营养物质、重金属离子和有机污染物是目前治理水质污染的新途径。该方法具有成本低、能耗小等优点。但是，水体藻类的异常生长(即赤潮现象)又会严重威胁水体的生态平衡，从而造成藻类污染。因此，在利用藻类治理环境的过程中，实时监测藻类的生长状况就显现的尤为重要。已有研究表明，藻体在疯狂生长之前，藻细胞将分泌大量的促进藻体生长的蛋白质(如碱性磷酸酯酶，碳酸酐酶)，因而研究者们把这些所分泌的酶的量作为来预测藻体的生长趋势的指标之一。目前，对蛋白质检测应用最多的方法是酶联免疫法，但是这种方法存在因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于目标蛋白酶自身催化性质的检测方法，与藻体生长相关的碳酸酐酶、碱性磷酸酶为目标蛋白,设计新型结构的DNA纳米器件作为探针，并结合蛋白酶自身的催化反应，将酶催化产物转化为单链DNA，从而通过单链DNA的测定来实现蛋白酶的检测，其特征在于，包括对碳酸酐蛋白酶的测定方法以及对碱性磷酸蛋白酶的测定方法，/n其中，对碳酸酐蛋白酶的测定方法包括以下步骤：/nS1、基于碳酸酐酶的催化反应进行方案设计，碳酸酐酶的催化反应的方程式如下：/n

【技术特征摘要】
1.一种基于目标蛋白酶自身催化性质的检测方法，与藻体生长相关的碳酸酐酶、碱性磷酸酶为目标蛋白,设计新型结构的DNA纳米器件作为探针，并结合蛋白酶自身的催化反应，将酶催化产物转化为单链DNA，从而通过单链DNA的测定来实现蛋白酶的检测，其特征在于，包括对碳酸酐蛋白酶的测定方法以及对碱性磷酸蛋白酶的测定方法，
其中，对碳酸酐蛋白酶的测定方法包括以下步骤：
S1、基于碳酸酐酶的催化反应进行方案设计，碳酸酐酶的催化反应的方程式如下：



S2、设计对H+有响应作用的DNA探针作为H+的捕获探针；
S3、当有碳酸酐酶存在时，碳酸酐酶将会催化测试底液中的CO2转化为HCO3-同时产生H+，所产生的H+将会去刺激所设计的DNA纳米探针，使DNA纳米探针发生构象变化，释放出两条有部分序列相同的DNA单链RS1和RS2，从而将碳酸酐蛋白酶的测定转换为DNA单链的测定；
S4、基于捕获探针和无酶DNA双循环放大策略构建电化学生物传感器的敏感界面；
S5、利用电化学生物传感器通过输出的电化学信号的大小可间接的测得碳酸酐酶的量；
其中，对碱性磷酸蛋白酶的测定方法包括以下步骤：
A1、基于碱性磷酸蛋白酶的水解反应进行方案设计，碱性磷酸蛋白酶的水解反应的方程式如下：



A2、选取步骤S2中设计的DNA纳米探针中的单链TS的5’端磷酸单酯作为碱性磷酸酶的催化底物，DNA纳米探针中其它单链DNA的5’都提前做去磷酸化处理，当没有碱性磷酸酶存在时，T4连接酶将会使DNA结构中的TS与RS之间生成磷酸二酯酶键，S2不能使DNA纳米探针发生构象变化，从而不能释放出TS和RS两条单链DNA，相反，在有碱性磷酸酶存在的情况下，碱性磷酸酶将会催化RS的5’的磷酸根水解，得到去磷酸化的DNA单链TS；
A3、所对应的DNA纳米探针将会在有S2存在时发生构象变化，释放出TS和RS两条单链DNA，成功的将碱性磷酸蛋白酶的测定转换为对DNA单链定量的测定；
A4、基于捕获探针和无酶DNA双循环放大策略构建电化学生物传感器的敏感界面；
A5、利用电化学生物传感器通过输出的电化学信号的大小可间接的测得碱性磷酸酶的量。


2.根据权利要求1所述的一种基于目标蛋白酶自身催化性质的检测方法，其特征在于，所述对碳酸酐蛋白酶的测定方法中，由于在藻体爆发式生长过程中，会使水中溶解无机碳的浓度降低，低浓度的溶解无机碳(DIC)将促使藻体细胞分泌大量碳酸酐酶以保证对CO2的有效利用，维持藻体较快的生长速率，碳酸酐酶将催化胞内的CO2转化为HCO3-,避免CO2从胞内CO2向外流失，在这一...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨哲涵，卿敏，吴虹，张晓龙，
申请(专利权)人：重庆工商大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50