一种具有良好固氮能力的褐球固氮菌突变体及其应用制造技术

一种具有良好固氮能力的褐球固氮菌突变体及其应用，其为固褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)A2820，保藏编号为CGMCC No.20443，保藏编号为CGMCC No.20443，保藏日期为2020年7月24日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其固氮酶活性210‑280nmol·mg

【技术实现步骤摘要】
一种具有良好固氮能力的褐球固氮菌突变体及其应用
本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种具有良好固氮能力的褐球固氮菌突变体及其应用。
技术介绍
中国作为世界上最大的氮肥生产和消费国，农业系统中的氮肥盈余成为环境污染因子，目前我国的氮肥使用量远远超过作物最高产量需求量，这些过多消耗的氮肥成为环境污染的主要因素。生物固氮是工业氮肥最有效的替代品之一，可通过控制氮肥的使用，从传统的工业氮肥转为生物固氮，提高氮肥利用率，建设环境友好型农业，同时能够减少温室气体、酸雨及地表水和地下水的硝酸盐污染。细菌的固氮酶能够利用来自ATP水解的电子、质子和能量，将空气中的分子氮(N2)还原成氨(NH3)，固氮菌通过固氮酶的活性进行生物固氮可以提高全球生产力。褐球固氮菌(Azotobacterchroococcum)是一种自生固氮菌，其不需要与一定的植物相配合，具有适应性广的特点，在天然生态系统的氮素循环中具有重要作用，是重要的农业菌剂，已有研究证实，褐球固氮菌对春小麦、枸杞、棉花等作物的生长有显著的促进作用，还可提高氮肥的利用率以及减少氮肥用量，接种褐球固氮菌可以减少50％棉花生长所需氮肥的施用量，褐球固氮菌在农业的中具有广泛的应用前景。常压室温等离子体(atmosphericandroomtemperatureplasma，ARTP)诱变育种技术目前在生物育种领域应用广泛，通过育种仪产生均匀的等离子体射流对待处理的细胞群体进行诱变，经ARTP诱变的菌株会随着等离子体射流处理时间的增加而导致碱基与核糖之间、碱基上的氨基以及磷酸二酯中的P-O键发生断裂，将寡核苷酸链断裂成小片段，最终形成多个突变位点而改变菌株的基因序列。目前，ARTP已经成功应用于包括细菌、真菌和微藻在内的40多种微生物的诱变育种，相比于传统诱变方法，射流中具有化学活性的粒子能够引发种类非常丰富的DNA损伤，最终得到大容量突变库，大容量突变库容易快速获得性能优良及遗传稳定的诱变菌株，且ARTP诱变育种技术操作简便、安全无毒，目前，对固氮菌株的诱变还鲜有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有良好固氮能力的褐球固氮菌突变体及其应用，通过ARTP诱变褐球固氮菌，用乙炔还原法测定并筛选出一株高酶活突变株A2820，具有良好的固氮能力，经多次传代培养确定其遗传稳定性，固氮酶活性测定结果表明，与诱变前菌株相比，提升了101.72％。为了达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种具有良好固氮能力的褐球固氮菌突变体，其为A2820，分类命名为固褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)，于2020年7月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.20443。本专利技术所述褐球固氮菌突变体，固氮酶活性210-280nmol·mg-1·h-1，菌落较小，单菌落直径1-2mm，表面呈淡黄色，表面及边缘光滑，显微镜下常呈“8”字或成对排列。进一步，所述褐球固氮菌突变体适于生长的无氮固体培养基为：蔗糖3.0-6.0g，KH2PO41.0-3.0g，K2HPO41.0～3.0g，MgSO4·7H2O0.3-0.5g，FeCl30.002-0.01g，CaCO30.05-0.2g，蒸馏水定容至1.0L，pH7.0～7.5，15.0～20.0g琼脂。本专利技术所述具有良好固氮能力的褐球固氮菌突变体的选育方法，包括如下步骤：1)制备菌体悬浮液将褐球固氮菌CICC21686种子液接种至固氮菌种子培养基中，于28℃、200r·min-1培养48h，取菌液至无菌EP管中，于4000r·min-1、4℃离心10min，弃去上清液，菌体用无菌生理盐水悬浮，稀释至OD600为0.6～0.8，获得菌体悬浮液；固氮菌种子培养基为：酵母提取物0.5g，甘露醇20.0g，KH2PO40.2g，K2HPO40.8g，MgSO4·7H2O0.2g，CaSO4·2H2O0.1g，FeCl30.02g，Na2MoO4·2H2O0.03g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1.0L，pH7.2；2)ARTP诱变将上述菌体悬浮液与10％甘油按1：1的比例混合，均匀涂布于与ARTP诱变仪配套使用的无菌不锈钢载片上，ARTP功率120W，通氦气载气流速10L·min-1，冷却水循环机温度为20℃，处理时间从0秒开始，每4秒做一个递增，至52秒，共14个处理,每个样品处理结束后，不锈钢载片会自动掉落至装有无菌生理盐水的无菌EP管内，待样品全部处理完毕后取下EP管，在振荡器上将菌体振荡洗脱；统计不同处理时间下无氮培养基平板上的菌落数，按以下公式计算致死率：式中，A指经ARTP处理后平板上生长出的菌落数，B指样品诱变处理0s的总菌落数；3)变异菌株筛选平板初筛：取经过上述ARTP诱变后振荡洗脱的菌液200μL，均匀涂布在无氮固体培养基上，每个时间梯度涂布3个无氮培养基平板作为三组平行，28℃培养48h；从各试验组中的无氮培养基平板上共挑选出36个生长状态良好、菌落较大的单菌落，对照组的菌株编号为1号，各试验组的菌株按照挑选顺序分别编号为2～37号，接种至无氮培养基液体试管，于28℃、200r·min-1培养48h，测定36个初筛菌株的固氮酶活性，筛选出发生正突变且固氮酶活性大幅提升的菌株；复筛：将筛选出的正向突变菌株转接至无氮液体培养基28℃、200r·min-1培养48h后转接至固氮斜面培养基，28℃培养48h，测定复筛菌株的固氮酶活性，验证菌株的酶活稳定性；其中，固氮酶活性的测定方法为：采用乙炔还原法测定固氮酶活性，固氮菌株在斜面培养基培养48h后更换橡胶塞，向体系注入乙炔气体，使其体积终浓度为10％，28℃继续培养4h，取反应气体用气相色谱仪测定，根据乙烯标准工作曲线计算乙烯生成量；菌株固氮酶活性用每毫克菌体每小时将乙炔还原为乙烯的量表示，按照以下公式计算：式中，P为气压(毫米汞柱)，t为反应温度(℃)，菌体蛋白量的测定采用考马斯亮蓝法，根据牛血清白蛋白标准曲线计算菌体蛋白含量；其中，牛血清白蛋白标准曲线的绘制：取7只试管，分别加入浓度为0.5mg·mL-1的牛血清白蛋白溶液0mL，0.1mL，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL，再依次分别加入1.0mL，0.9mL，0.8mL，0.6mL，0.4mL，0.2mL，0mL蒸馏水，每支试管加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液；振荡摇匀各试管内液体，静置5min，测定595nm处吸光值A595，以标准蛋白浓度为横坐标，A595为纵坐标，绘制标准曲线。4)诱变菌株的遗传稳定性分析为了验证突变株的遗传稳定性，以无氮固体培养基传无氮固体培养基为一代，将复筛后获得的最优突变株A2820传代培养5代，每代均接种装有3mL无氮培养基液体试管，28℃、200r·min-1培养72h，测定每一代菌株的固氮酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有良好固氮能力的褐球固氮菌突变体，其为固褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)A2820，保藏编号为CGMCC No.20443，保藏日期为2020年7月24日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有良好固氮能力的褐球固氮菌突变体，其为固褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)A2820，保藏编号为CGMCCNo.20443，保藏日期为2020年7月24日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。


2.根据权利要求1所述褐球固氮菌突变体，其特征在于，其固氮酶活性210-280nmol·mg-1·h-1，单菌落直径1-2mm，表面呈淡黄色，表面及边缘光滑，显微镜下常呈“8”字或成对排列。


3.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄艳娜，唐雪明，段赛菲，王金斌，宋丽莉，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31