基于药物基因多态性及血栓弹力图的血小板治疗指导方法技术

本发明专利技术涉及血小板技术领域，尤其涉及一种基于药物基因多态性及血栓弹力图的血小板治疗指导方法，包括以下步骤：S1、药物基因检测；S2、全血基因组DNA测序；S3、进行代谢型分类；S4、TEG检测；S5、结果分析，本发明专利技术中，根据药物基因多态性联合TEG指导轻型缺血性卒中抗血小板治疗能有效降低90d内新发卒中风险，且不会增加出血风险。基因检测联合TEG可及时发现对抗血小板药物治疗不敏感的患者，能为抗血小板治疗药物的选择提供新的依据，使缺血性卒中患者能更加精准、合理地选择抗血小板药物，从而制定个体化的抗血小板治疗方案，有效降低卒中复发的风险，对于缺血性卒中二级预防具有重要的指导意义，值得临床推广应用。

【技术实现步骤摘要】
基于药物基因多态性及血栓弹力图的血小板治疗指导方法
本专利技术涉及血小板
，尤其涉及一种基于药物基因多态性及血栓弹力图的血小板治疗指导方法。
技术介绍
轻型缺血性卒中患者发生后续卒中的短期风险很高，极有可能导致残疾，尤其是在卒中后的前90d。CHANCE研究发现轻型缺血性卒中或短暂性脑缺血发作(TIA)后24h内给予阿司匹林联合氯吡格雷治疗21d比单独使用阿司匹林能够降低32％卒中复发风险，并且未增加出血的并发症。POINT研究的二次分析也证实在发病以后的前21d使用双抗治疗降低缺血性事件的获益最大，而21d后继续使用双抗治疗则获益将被增加的出血风险抵消。因此，目前国内外指南均推荐对未曾接受阿替普酶静脉溶栓的非心源性轻型缺血性卒中患者，应尽早启动阿司匹林和氯吡格雷双联抗血小板治疗并维持21d。然而，有文献报道3％～85％服用阿司匹林及4％～30％服用氯吡格雷的患者，即使长期规律服药，仍有脑卒中复发的风险，临床预后并没有得到改善，这可能与患者对抗血小板药物的反应性降低有关。有学者将这种患者对抗血小板药物反应性降低的现象，称为“抵抗”。阿司匹林抵抗(aspirinresistance，AR)、氯吡格雷抵抗(clopidogrelresistance，CR)是预防和治疗部分缺血性卒中失败的重要原因，并将大大增加缺血性卒中的复发风险。有关AR及CR发生的机制比较复杂，目前尚不十分明确，以往的研究显示抗血小板药物代谢及作用过程中涉及的相关基因多态性可能是一个重要因素。目前，国内尚无根据国人状况的个体化、标准化的抗血小板治疗体系。血小板抑制作用因人而异，实现个体化抗血小板治疗是抗栓治疗急需研究解决的问题。因此，我们提出了一种基于药物基因多态性及血栓弹力图的血小板治疗指导方法用于解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种基于药物基因多态性及血栓弹力图的血小板治疗指导方法。基于药物基因多态性及血栓弹力图的血小板治疗指导方法，包括以下步骤：S1、药物基因检测：通过PCR和Sanger法测序技术检测阿司匹林和氯吡格雷相关的基因多态性位点；S2、全血基因组DNA测序：取静脉血2ml于EDTA抗凝管中，利用全血基因组DNA提取试剂盒来提取DNA，再将提取的DNA进行PCR扩增，最后将扩增产物使用测序仪进行测序；S3、进行代谢型分类：根据基因型进行代谢型分类，分为强代谢型和弱代谢型；S4、TEG检测：使用TEG5000型凝血分析仪对肘静脉血进行分析，2h内检测AA途径诱导的血小板抑制率(AA％)和ADP受体途径诱导的血小板抑制率(ADP％)；S5、结果分析：AA抑制率＜50％，定义为AR；ADP抑制率＜30％，定义为CR。优选的，所述S1中，阿司匹林相关基因检测COX-1(A>G)、ITGB3(T>C)基因，其中G、C为阿司匹林抵抗相关等位基因；氯吡格雷相关基因检测CYP2C19基因*2(681G/A)、*3(636G/A)、*17(-806C/T)。优选的，所述S2中，DNA测序前经过酶切反应，酶切反应条件：变性：94℃，5min，94℃，30s；退火：56℃，20s；延伸：72℃，20s；共35个循环，最后72℃延伸5min。优选的，功能缺失等位基因携带者为至少有1个功能缺失等位基因的患者：*1/*2、*1/*3、*2/*2、*2/*3、*3/*3、*2/*17或*3/*17；功能缺失等位基因非携带者为无功能缺失等位基因的患者：*1/*1，*1/*17，或*17/*17。优选的，所述S4中，根据CYP2C19*2、*3和*17基因型进行代谢型分类，分为强代谢型：野生型纯合子组CYP2C19*1/*1的快代谢型、CYP2C19*1/*17的超快代谢型；优选的，弱代谢型：野生型与突变基因杂合子组：CYP2C19*1/*2和*1/*3的中间代谢型、突变基因纯合子或杂合子组：CYP2C19*2/*2、2/*3和*3/*3的慢代谢型。优选的，所述凝血分析试剂包括高岭土、激活剂、花生四烯酸和二磷酸腺苷。优选的，所有数据均采用SPSS17.0统计软件包进行处理。优选的，计量资料符合正态分布的采用均数±标准差表示，不符合正态分布的采用中位数，两组间均数比较采用独立样本t检验，计数资料用例数和百分率表示，组间比较采用χ2检验。优选的，所有检验均为双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。本专利技术的有益效果是：根据药物基因多态性联合TEG指导轻型缺血性卒中抗血小板治疗能有效降低90d内新发卒中风险，且不会增加出血风险。基因检测联合TEG可及时发现对抗血小板药物治疗不敏感的患者，能为抗血小板治疗药物的选择提供新的依据，使缺血性卒中患者能更加精准、合理地选择抗血小板药物，从而制定个体化的抗血小板治疗方案，有效降低卒中复发的风险，对于缺血性卒中二级预防具有重要的指导意义，值得临床推广应用。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步解说。本实施例中，选取2018年1月至2020年04月在江苏大学附属武进医院接受治疗的250例急性轻型缺血性卒中患者的临床资料，纳入标准:(1)年龄≥18岁；(2)首次非心源性急性轻型缺血性卒中，定义为由血管原因引起的突发性局灶性神经功能障碍，美国国立卫生研究院卒中量表评分(NIHSS)≤3分；(3)头颅CT或MRI排除出血或证实新发脑梗死；(4)发病时间≤48h，并能在症状出现后48h内开始给予抗血小板药物治疗。如果符合下列标准之一，患者将被排除在参与研究范围之外，排除标准：(1)有出血或其他情况，如血管畸形、创伤、肿瘤、脓肿、神经退行性疾病等；(2)动脉炎、遗传性急性缺血性脑血管病等非动脉粥样硬化致急性缺血性脑血管病；(3)在CT或MRI基础上没有急性梗死的证据；(4)有明确的抗凝治疗指征(可能是心源性栓塞，如房颤或人工心脏瓣膜)；(5)有出血倾向、活动性消化性溃疡及近期活动性出血等氯吡格雷或阿司匹林禁忌征；(6)严重精神疾病症状临床不能配合的患者；(7)全身性传染病、自身免疫性疾病、严重的心、肝、肾疾病；(8)有颅内出血史、3个月前有消化道出血或消化道内大手术史；(9)服用质子泵抑制剂；(10)合并有血液疾病者，血小板计数＞450×10/L或＜100×10/L或血红蛋白＜80g/L；(11)长期服用非甾体类抗炎药物或阿司匹林、氯吡格雷以外的抗血小板药物；(12)筛查后3个月内有血管重建术计划可能；(13)有严重的非心血管疾病并存，预期寿命不足3个月。纳入本研究中的所有患者均符合动脉粥样硬化性急性缺血性脑卒中诊断，均在静脉溶栓时间窗之外，未接受溶栓治疗，所有患者均使用氯吡格雷和阿司匹林进行抗血栓治疗。本研究经江苏大学附属武进医院伦理委员会批准，参与本研究的患者具有完整的临床资料，所有患者或监护人签署知情同意书。随机分组与治疗：诊断急性轻型缺血性卒中患者，在出现症状的48h内按1:1的比例随机分配给试验组或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于药物基因多态性及血栓弹力图的血小板治疗指导方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、药物基因检测：通过PCR和Sanger法测序技术检测阿司匹林和氯吡格雷相关的基因多态性位点；/nS2、全血基因组DNA测序：取静脉血2ml于EDTA抗凝管中，利用全血基因组DNA提取试剂盒来提取DNA，再将提取的DNA进行PCR扩增，最后将扩增产物使用测序仪进行测序；/nS3、进行代谢型分类：根据基因型进行代谢型分类，分为强代谢型和弱代谢型；/nS4、TEG检测：使用TEG5000型凝血分析仪对肘静脉血进行分析，2h内检测AA途径诱导的血小板抑制率(AA％)和ADP受体途径诱导的血小板抑制率(ADP％)；/nS5、结果分析：AA抑制率＜50％，定义为AR；ADP抑制率＜30％，定义为CR。/n

【技术特征摘要】
1.基于药物基因多态性及血栓弹力图的血小板治疗指导方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、药物基因检测：通过PCR和Sanger法测序技术检测阿司匹林和氯吡格雷相关的基因多态性位点；
S2、全血基因组DNA测序：取静脉血2ml于EDTA抗凝管中，利用全血基因组DNA提取试剂盒来提取DNA，再将提取的DNA进行PCR扩增，最后将扩增产物使用测序仪进行测序；
S3、进行代谢型分类：根据基因型进行代谢型分类，分为强代谢型和弱代谢型；
S4、TEG检测：使用TEG5000型凝血分析仪对肘静脉血进行分析，2h内检测AA途径诱导的血小板抑制率(AA％)和ADP受体途径诱导的血小板抑制率(ADP％)；
S5、结果分析：AA抑制率＜50％，定义为AR；ADP抑制率＜30％，定义为CR。


2.根据权利要求1所述的基于药物基因多态性及血栓弹力图的血小板治疗指导方法，其特征在于，所述S1中，阿司匹林相关基因检测COX-1(A>G)、ITGB3(T>C)基因，其中G、C为阿司匹林抵抗相关等位基因；氯吡格雷相关基因检测CYP2C19基因*2(681G/A)、*3(636G/A)、*17(-806C/T)。


3.根据权利要求2所述的基于药物基因多态性及血栓弹力图的血小板治疗指导方法，其特征在于，所述S2中，DNA测序前经过酶切反应，酶切反应条件：变性：94℃，5min，94℃，30s；退火：56℃，20s；延伸：72℃，20s；
共35个循环，最后72℃延伸5min。


4.根据权利要求3所述的基于药物基因多态性及血栓弹力图的血小板治疗指导方法，其特征在于，功能缺失...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈文亚，毛伦林，季莉莉，马爱金，刘志清，王利惠，张金，王佳佳，黄婷婷，
申请(专利权)人：常州市武进人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32