富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的方法、培养基以及培养基的制备方法技术

本发明专利技术公开一种可以从海水环境样品中富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的培养基及其制备方法，所述培养基的组分包括marine broth 2216、脑心浸液琼脂、琼脂、FeCl

【技术实现步骤摘要】
富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的方法、培养基以及培养基的制备方法
本专利技术属于微生物分离培养
，具体涉及一种从海水环境样品中富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的方法、培养基以及培养基的制备方法。
技术介绍
弗朗西斯菌科(Francisellaceae)是具有重要临床意义的病原菌，它们具有胞内寄生、宿主免疫逃逸机制以及伤口接触污染水源、土壤或食物的传播方式等特征。土拉热病(Tularemia)是由土拉弗朗西斯菌(F.tularensis)引起的可导致人类和各种动物急性死亡的疾病，其临床感染主要与接触疫水、节肢动物叮咬及猎杀野生动物后剥皮过程的气溶胶吸入有关，且具有“自然宿主众多、传播途径多样、临床表现多样”等特征。目前，世界范围仍有土拉热病的散发和暴发流行，并且，该病临床诊断困难且对头孢菌素类抗生素天然耐药。依据《伯杰氏系统细菌学手册》第二版，弗朗西斯菌(Francisellaceae)隶属γ-变形菌纲，硫发菌目(Thiotrichales)，弗朗西斯菌科(Francisellaceae)。目前，弗朗西斯菌科(Francisellaceae)仅包括一个单一的弗朗西斯菌属(Francisella)，弗朗西斯菌属包括土拉弗朗西斯菌(F.tularensis)、新凶手弗朗西斯菌(F.novicida)和蜃楼弗朗西斯菌(F.philomiragia)等菌种，模式菌种为土拉弗朗西斯菌。弗朗西斯菌属是一类革兰氏阴性、镜下呈沙粒状、无芽孢、无鞭毛、无动力的短杆菌或球杆菌，可胞内寄生，长时间培养后呈多形性，可呈球状、杆状和丝状，菌体直径在0.2μm-1.7μm，具有一定的抗酸性，L-半胱氨酸可促进该菌属生长，但并非生长所必需。弗朗西斯菌属为严格需氧性细菌，属内仅西班牙弗朗西斯菌(F.hispaniensis)触酶阴性，其余均为弱阳性。Kovacs改良法氧化酶试验时，土拉弗朗西斯菌、蜃楼弗朗西斯菌和西班牙弗朗西斯菌呈现阳性，船城弗朗西斯菌(F.noatunensis)氧化酶阴性。利用16SrDNA序列相似度分析，能将大部分弗朗西斯菌鉴定到亚种水平，一些管家基因，如rpoB、shdA、mdh、groEL、rpoA、pgm和atpA是鉴定弗朗西斯菌的辅助鉴定靶位，对某些种间16SrDNA具有较高一致性的弗朗西斯菌，根据管家基因序列相似度与重建的系统发育树能将弗朗西斯菌准确鉴定到种。弗朗西斯菌及其邻近类群物种(包括弗朗西斯菌科(Francisellaceae)、苛养杆菌科(Fastidiosibacteraceae)以及其他亲缘关系相近的菌种)在自然界中的存在广泛，且生态环境复杂多变，其不仅存在于各种淡水和咸水环境中，水生环境中的单细胞原虫、水生浮游动物以及节肢动物和脊椎动物等，也均可能成为其繁殖和扩散的载体。但目前弗朗西斯菌及其邻近类群物种的物种资源仍相对匮乏，弗朗西斯菌科、苛养杆菌科(Fastidiosibacteraceae)和柯克斯体科(Coxiellaceae)中已描述的物种数量均不超过10个。弗朗西斯菌等相关类群细菌对于疾病具有潜在的致病性，且部分菌种致病能力强、自然宿主多、传播途径多样、对社会危害性大；故认知这些类群的物种多样性及分布规律，对于其流行病学预防尤为重要。科赫法则认为，纯培养是一切感染性疾病研究的基础。微生物纯培养的获得，不仅是感染性疾病诊断、耐药性、致病性和流病学调查研究的基础，也是后续减毒活疫苗研发和疾病预防和治疗的基础。鉴于弗朗西斯菌及其邻近类群物种具有重要临床意义，故其纯培养研究亦具有十分重要的研究价值。弗朗西斯菌属于苛养性细菌，专性需氧，对分离培养要求较高，培养时间较长且培养难度大。目前尚无弗朗西斯菌分离培养的标准方法，较为常用的人工培养基有CHAB、巧克力平板、TM平板(Tyayer-Martinagar)和缓冲活性碳酵母平板(BCYEα)。弗朗西斯菌在分离过程中容易被其他微生物覆盖。培养基中可以根据环境样品分离需要添加不同的抗生素制作成选择培养基，可提高环境样品中弗朗西斯菌的分离效率，如CHAB-A平板、CHAB-PACCV平板、BCYEα-GVPC平板等。除了添加抗生素之外，在接种前对样品进行酸处理和热处理也可抑制样品中其他微生物的生长(详见：顾全,屈平华,陈守义,朱庆义.弗郎西斯菌分类鉴定与流行趋势的研究进展[J].微生物学通报,2015,42(02):393-399)。现有用于弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种分离培养，特别是用于海水环境样品中的弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种分离培养的培养基和方法，可在一定程度上抑制样品中其他微生物的生长，降低弗朗西斯菌及其邻近类群物种的分离难度，但仍不能满足弗朗西斯菌及其邻近类群物种纯培养的要求，目标微生物检出率低，目标微生物被分离的概率低，从而不利于弗朗西斯菌及其和/或其邻近类群物种中的新物种的分离和物种多样性的描述。
技术实现思路
本专利技术的其中一个目的在于提供一种可以从海水环境样品中富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的培养基及其制备方法。本专利技术提供的培养基，既可以有效抑制样品中其他杂菌的生长，降低目标微生物分离难度，又有利于弗朗西斯菌及其邻近类群物种的生长，从而可以使弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种出现的个体数量增加，物种多样性增加，显著提高目标微生物被分离的概率。根据本专利技术的另一个目的在于提供一种可以从海水环境样品中富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的方法，利用本专利技术的方法，可以使目标微生物可以有效检出。根据本专利技术的一个方面，提供了一种富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的培养基，其中，每1L培养基中，包括以下组分：marinebroth221630-45g，脑心浸液琼脂20-30g，琼脂1-10g，FeCl30.2-0.5g，L-半胱氨酸0.2-0.6g，GVPC10-30mL，葡萄糖5-15g和浓度为3-8％的热灭活的绵羊红细胞20-60mL。本专利技术中，所述弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种包括弗朗西斯菌科(Francisellaceae)、苛养杆菌科(Fastidiosibacteraceae)以及其他亲缘关系相近的菌种；而所述其他亲缘关系相近的菌种包括：鱼立克次体科(Piscirickettsiaceae)和硫发菌科(Thiotrichaceae)等。本专利技术通过选择CHAB培养基作为基础培养基，结合弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的生长特性以及模拟海水环境多盐离子环境，通过调整部分组分的用量以及添加marinebroth2216、FeCl3和GVPC等成分，对CHAB培养基进行了优化，使其可以有效抑制除目标微生物以外的杂菌的生长，并为目标微生物的生长模拟良好的海水原生态环境，促进目标微生物的生长，从而可以有效提高海水环境样品中目标微生物被分离的概率。在一些实施方式中，培养基的pH可以为6.8-7.2。在一些实施方式中，每1L培养基中，可以包括以下组分：marinebroth221635-40g，脑心浸液琼脂23.5-27.5g，琼脂4-6g，F本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的培养基，其中，所述培养基的pH为6.8-7.2，每1L培养基中，包括以下组分：marine broth 2216 30-45g，脑心浸液琼脂20-30g，琼脂1-10g，FeCl

【技术特征摘要】
1.富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的培养基，其中，所述培养基的pH为6.8-7.2，每1L培养基中，包括以下组分：marinebroth221630-45g，脑心浸液琼脂20-30g，琼脂1-10g，FeCl30.2-0.5g，L-半胱氨酸0.2-0.6g，GVPC10-30mL，葡萄糖5-15g和浓度为3-8％的热灭活的绵羊红细胞20-60mL。


2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，每1L培养基中，包括以下组分：marinebroth221635-40g，脑心浸液琼脂23.5-27.5g，琼脂4-6g，FeCl30.30-0.35g，L-半胱氨酸0.35-0.45g，GVPC18-22mL，葡萄糖9-11g和浓度为5％的热灭活的绵羊红细胞35-45mL。


3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，每1L培养基中，包括以下组分：marinebroth221637.4g，脑心浸液琼脂25g，琼脂5g，FeCl30.325g，L-半胱氨酸0.4g，GVPC20mL，葡萄糖10g和浓度为5％的热灭活的绵羊红细胞40mL。


4.权利要求1-3任一项所述的培养基的制备方法，包括如下步骤：
取marinebroth2216，加水后加热溶解，去除杂质，得A液；
取脑心浸液琼脂和琼脂，加水溶解，得B液；
取FeCl3、L-半胱氨酸和葡萄糖，加水溶解后，除菌，然后加入GVPC和热灭活的绵羊红细胞，混合，得C液；
将A液和B液混合，调节pH，灭菌，然后与C液混合，倒平板，即得。


5.根据权利要求4所述的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈茶，屈平华，李良慧，张伟铮，李松，蔡依玫，冯俊慧，林冬玲，张轩，邓光远，
申请(专利权)人：广东省中医院广州中医药大学第二附属医院，广州中医药大学第二临床医学院，广东省中医药科学院，
类型：发明
国别省市：广东;44