一株益生芽胞杆菌的筛选及应用制造技术

本发明专利技术属于农业微生物应用领域，具体涉及一株益生芽胞杆菌的筛选及应用。本发明专利技术与反刍动物瘤胃消化相关的益生素添加剂的筛选和应用有关。本发明专利技术筛选得到一株对肉牛有显著促生长效用的副地衣芽胞杆菌菌株，经过16S rRNA基因鉴定、益生性能检测、安全性评价和抗逆性能的鉴定，验证了本发明专利技术可以作为肉犊牛饲料添加剂促生长的应用。本发明专利技术的副地衣芽胞杆菌菌株(Bacillus paralicheniformis)SN‑6，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020136。所述菌株生长速度快、抗逆性强、安全和促进生长，可作为畜禽饲用微生态添加剂。

【技术实现步骤摘要】
一株益生芽胞杆菌的筛选及应用
本专利技术属于农业微生物应用领域，具体涉及一株益生芽胞杆菌的筛选及应用。本专利技术与反刍动物瘤胃消化相关的益生素添加剂的筛选和应用有关。本专利技术筛选得到一株对肉牛有显著促生长效用的副地衣芽胞杆菌菌株，经过分离鉴定、益生性能检测、安全性评价和抗逆性能的鉴定，表明本专利技术可以作为肉犊牛饲料添加剂促生长应用。
技术介绍
全球碳循环的一个关键步骤是水解植物细胞壁中的纤维素，纤维素是陆地上最丰富的碳源(Malhi2003，David2011)。纤维素资源的合理利用，能够缓解污染、解决全球能源危机以及动物饲料资源紧张等世界性难题。微生物能够水解纤维素生成还原糖(纤维二糖、葡萄糖等)(Vu2012)，可提高饲料利用率、降低饲料成本、提高畜禽生产力、具有广阔的开发前景。在畜牧业和饲料工业中，为了解决能量饲料短缺的问题，人们高度重视产纤维素酶和木质素酶的微生物分离筛选及纤维素酶、木质素酶的应用。纤维素分解菌被称为动物肠道微生物的“关键物种”(苏少锋2019)。McBee等研究显示反刍动物80％以上的纤维素消化依靠瘤胃内的微生物，且饲用微生物能够提高纤维利用率(McBee1971)。Sun等报道，饲喂枯草芽胞杆菌后，荷斯坦奶牛瘤胃中纤维素的消化作用提高，显著提高了犊牛断奶前的日增重(Sun2010)。肉牛饲料中粗饲料占据较大比重，但粗饲料中富含难以被消化利用的纤维素、木质素，造成资源的浪费。水牛与肉牛同属于反刍动物，均以瘤胃作为主要的饲料发酵场所，而水牛较肉牛更耐粗饲。有理由推测：水牛的耐粗饲性与其独特的胃肠道微生物密切相关。目前尚未见到从水牛瘤胃中分离筛选出降解纤维素、木质素等活性强的菌株，也未见到一株兼备纤维素和木质素降解能力、对肉牛具有显著促生长作用的副地衣芽胞杆菌的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，针对粗饲料中木质素、纤维素不易被降解的技术壁垒，分离筛选一株安全、降解木质素、纤维素能力强的益生菌，利用微生物菌剂提高肉牛对粗饲料的利用率，提高生产率且安全、高效、环保。经16SrDNA鉴定，本专利技术分离得到的益生菌株为副地衣芽胞杆菌(Bacillusparalicheniformis)，本专利技术对其产酶(纤维素酶、木质素酶、淀粉酶、蛋白酶)活性、安全性、益生性及作为肉牛饲料添加剂促生长的效果进行了相关验证。本专利技术的技术方案如下：本专利技术根据筛选目标和益生菌产特定酶性能为标准，从抗粗饲强的水牛瘤胃中，分离筛选得到一株候选菌株，专利技术人经过鉴定，将所得的候选菌株命名为副地衣芽胞杆菌SN-6，BacillusparalicheniformisSN-6，于2020年05月21日送到中国.武汉.武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2020136。副地衣芽胞杆菌(Bacillusparalicheniformis)SN-6菌株的菌学特性：副地衣芽胞杆菌(Bacillusparalicheniformis)SN-6菌株为革兰氏阳性，呈单在、成双或链状排列的短杆菌，能形成芽胞。在以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源平板上，长成白色、光滑、周边整齐、直径5mm左右的菌落(见图1A)，经刚果红染色，菌落周围产生淡黄色水解圈(见图1B)。在木质素磺酸钠为唯一碳源平板上点种，可长成直径3cm左右的白色菌苔(见图2)。在马铃薯葡萄糖琼脂(PotatoDextroseAgar，PDA)-愈创木酚上生长，菌落周围产生红棕色氧化圈(见图3)。克隆其16SrRNA基因并进行测序，在NCBI进行Blast比较，发现本专利技术的候选菌株16SrDNA序列与副地衣芽胞杆菌(MK517555.1)的同源性最高，为99.65％。副地衣芽胞杆菌SN-6菌株的繁殖能力较强，0-4h处于迟缓期，4h后进入对数生长期，持续到8h后进入稳定期。副地衣芽胞杆菌SN-6菌株产芽胞，具有很好的稳定性。耐受人工胃液和肠液，在pH3的人工胃液中孵育3h，存活率为36.36％。在中性人工肠液中孵育4h，存活率为54.29％。表明该菌株具有良好的耐受性，有利于制备成微生态制剂以及作为饲料添加剂应用于生产。副地衣芽胞杆菌SN-6菌株在以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源的平板上长出的菌落，经刚果红染色，菌落周围产生淡黄色水解圈(见图1B)，说明该菌株能够水解纤维素，外分泌纤维素酶。在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)-愈创木酚上生长，菌落周围产生红棕色氧化圈(见图3)，提示该菌株产漆酶。在含有1％可溶性淀粉的LB平板上生长，经革兰氏碘液染色，菌落周围形成白色褪色圈，说明该菌株产淀粉酶(见图5)，可提高能量物质淀粉的消化利用率。副地衣芽胞杆菌SN-6菌株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K99具有明显的抑菌活性(见图7)。对常用兽药如青霉素、头胞氨苄、诺氟沙星、四环素、万古霉素、氯霉素、呋喃唑酮、复方新诺明敏感，而对头胞呋辛表现中度敏感；对苯唑西林表现耐药。用PCR方法检测毒力基因，发现该菌株不含相关毒力基因(见图9)。小鼠饲喂试验表明，试验组小鼠与空白组相比未见异常。表明该菌株具有良好的安全性。申请人将本专利技术的SN-6菌株通过液体发酵方式制备成微生态制剂，用作饲料添加剂，进行了肉牛饲养试验，对肉犊牛有明显的促进生长的作用，达到了预期的效果，从而完成了本专利技术的任务。本专利技术的副地衣芽胞杆菌具有如下优点：(1)从耐粗饲的水牛瘤胃中分离的副地衣芽胞杆菌SN-6菌株降解粗纤维能力更强，提高肉牛日粮利用率的效果显著。(2)本专利技术SN-6菌株繁殖能力较强，产芽胞，稳定性强；可耐受人工胃液、肠液，在pH为3的人工胃液孵育3h，存活率为36.36％；在中性的人工肠液孵育4h，存活率为54.29％，有利于制备成微生态制剂及作为饲料添加剂应用于生产。(3)本专利技术对SN-6菌株用分子生物学的方法及小鼠饲喂试验进行了安全性淘选，安全性更高。(4)动物试验证明，本专利技术的微生态制剂对肉犊牛具有显著的促生长作用，达到了本专利技术最终目的。更详细的技术方案见《具体实施方案》的内容。附图说明图1：是本专利技术分离筛选的副地衣芽胞杆菌菌株SN-6在CMC-Na琼脂平板上的生长状态和利用刚果红染色经生理盐水脱色后的结果。附图标记说明：图1中的图1A是本专利技术分离筛选的副地衣芽胞杆菌菌株SN-6在CMC-Na琼脂平板上的生长状态。图1中的图1B图是刚果红染色后经生理盐水脱色后的结果，图中显示SN-6的菌落周围出现淡黄色水解圈。图2：副地衣芽胞杆菌SN-6在木质素唯一碳源平板上的生长情况。图3：副地衣芽胞杆菌SN-6在PDA-愈创木酚平板上的生长情况。图4：是本专利技术分离筛选的副地衣芽胞杆菌SN-6革兰氏染色结果(×1000)。图5：是本专利技术菌株SN-6产淀粉酶检测结果。图6：是本专利技术菌株SN-6产蛋白酶检测结果。图7：是本专利技术菌株SN-6发酵液上清体外抑菌结果。附图标记说明：图7抑菌圈的标记本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离筛选的降解纤维素、木质素，对致病金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K99具有抑菌作用的副地衣芽胞杆菌(Bacillus paralicheniformis)SN-6菌株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020136。/n

【技术特征摘要】
1.一种分离筛选的降解纤维素、木质素，对致病金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K99具有抑菌作用的副地衣芽胞杆菌(Bacillusparalicheniformis)SN-6菌株，保...

【专利技术属性】
技术研发人员：石德时，杨书敏，罗吉，周进，肖运才，李翔，王喜亮，李筱雯，周祖涛，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42