一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8及其应用制造技术

本发明专利技术涉及农业微生物技术领域，具体涉及一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8及其应用。本发明专利技术筛选得到的菌株，通过生理生态学分析以及分子生物学鉴定为枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis。该菌株可在以氨氮、亚硝态氮或硝态氮为唯一氮源的条件下生长，在异养好氧条件下通过同步硝化反硝化作用，24h将100mg/L氨氮、100mg/L硝态氮和25mg/L亚硝态氮的去除率分别达到73.7％、51.7％和100％，且不积累无机氮；对水体中50mg/L氨氮和12.5mg/L亚硝态氮混合氮源的去除率分别达到89.1％和100％，无硝酸盐积累；且对蓝藻有很好的防治效果。该菌株还具有较强的产淀粉酶和蛋白酶能力，耐酸、耐胆盐，与酵母菌和乳酸菌复合制成发酵饲料，可提高饲料中氨基酸和总蛋白含量。

【技术实现步骤摘要】
一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8及其应用
本专利技术涉及农业微生物
，具体涉及一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8及其应用。
技术介绍
随着水产养殖集约化程度的不断提高，残饵、排泄物、残体大量累积，加上农业退水的排放，致使养殖水体污染严重，最为突出的是养殖中后期氮素含量过高。水体中氮素含量过高会导致水体富营养化，藻类大量繁殖，消耗水体中的溶氧，使得水变腥臭，影响水产动物的生存。然而如何经济有效地去除养殖水体中的氮素，同时还能抑制蓝藻的产生，是水产养殖一直关注的问题。利用微生物硝化和反硝化作用去除水体中氮源污染物，具有修复时间短、操作简便、成本费用低、不会产生二次污染、污染物降解彻底等多种优势。传统理论一直认为，硝化和反硝化作用是两个完全独立的过程，分别在自养和厌氧条件下由不同的微生物完成。然而，1983年Robertson等首次发现菌株Thiosphaerapantotropha同时具有异养硝化和好氧反硝化能力，打破了传统的硝化和反硝化理论，目前大量在异养条件下具有硝化功能和好氧条件下具有反硝化功能的菌株被分离获得，其中部分菌种具有同步硝化反硝化能力。枯草芽胞杆菌(Bacillussubrilis)是一种短杆状、无荚膜、能运动的革兰氏阳性好氧菌，产中生芽孢。枯草芽胞杆菌具有易培养、繁殖快、易保存、对环境适应性强、无毒无污染的特点，是水产养殖一种常用的益生菌，主要利用其产胞外酶分解水体和底泥中的有机质从而降低水体的富营养化风险，未见报道其具有同步硝化反硝化能力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8及其应用，解决了现有技术中去除水体氮源污染物效率低，功能单一的问题。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8，所述枯草芽胞杆菌分类为Bacillussubtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年4月10日，保藏编号为CGMCCNo.19558。本专利技术还提供了一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8的应用，用于去除水体中氨氮、硝态氮和亚硝态氮。本专利技术还提供了一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8的应用，用于防治蓝藻。本专利技术还提供了一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8的应用，用于饲料发酵。本专利技术还提供了一种复合发酵剂，所述复合发酵剂中包括枯草芽胞杆菌K8、热带假丝酵母和希氏乳杆菌RX。作为优选，所述枯草芽胞杆菌K8、热带假丝酵母和希氏乳杆菌RX的体积比为1:1.5～2.5:4～6。本专利技术提供了一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8。本专利技术的枯草芽胞杆菌K8与现有技术相比具有以下优点：1、本专利技术的枯草芽胞杆菌K8具有同步硝化反硝化能力，脱氮速度快，24h将100mg/L氨氮、100mg/L硝态氮和25mg/L亚硝态氮的去除率分别达到73.7％、51.7％和100％，且不积累无机氮；对水体中50mg/L氨氮和12.5mg/L亚硝态氮混合氮源的去除率分别达到89.1％和100％，无硝酸盐积累；脱氮效率高，通过同步硝化反硝化作转化成气态氮。2、本专利技术的枯草芽胞杆菌K8同时具有防治蓝藻的效果，室内试验和田间试验均证明，该菌能杀灭铜绿微囊藻，防治蓝藻爆发。3、本专利技术的枯草芽胞杆菌K8与希氏乳杆菌、热带假丝酵母复合用于发酵饲料，活菌含量高，提高饲料的利用率和营养成分的含量。4、本专利技术的枯草芽胞杆菌K8的淀粉酶和蛋白酶的酶活值高；耐酸，在pH3.0和4.0的培养基上的OD值分别达到0.67和1.36；耐胆盐，在0.3％的胆盐中的存活率达到40.8％，在模拟胃液中的存活率达92.3％。附图说明图1为枯草芽胞杆菌K8基于16SrRNA基因序列构建的系统发育树；图2为枯草芽胞杆菌K8以氨氮为底物的脱氮效果；图3为枯草芽胞杆菌K8以硝态氮为底物的脱氮效果；图4为枯草芽胞杆菌K8以亚硝态氮为底物的脱氮效果；图5为枯草芽胞杆菌K8以氨氮和亚硝态氮为混合氮源的脱氮效果。保藏说明枯草芽胞杆菌K8，拉丁文为Bacillussubtilis，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年4月10日，保藏编号为：CGMCCNo.19558。具体实施方式本专利技术提供了一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8，所述枯草芽胞杆菌分类为Bacillussubtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年4月10日，保藏编号为CGMCCNo.19558。本专利技术还提供了一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8的分离筛选方法，包括如下步骤：(1)取南美白对虾养殖池底质活性污泥为待分离物；(2)将待分离物用无菌水稀释，得到稀释的待分离物；(3)将稀释的待分离物进行处理，得到处理的分离物；(4)采用平板划线法分离处理的分离物后，得到分离的K8菌落。在本专利技术中，所述稀释待分离物时的稀释倍数为待分离物体积的3～5倍，优选为4倍。在本专利技术中，处理所述稀释的待分离物的方法为水浴处理法。在本专利技术中，所述水浴处理法的温度为70～90℃，优选为80℃。在本专利技术中，所述水浴处理法的时间为10～20min，优选为15min。在本专利技术中，所述分离的K8菌落为单菌落。在本专利技术中，所述分离的K8的单菌落通过继代培养的方式进行纯化，得到纯化的K8菌株。在本专利技术中，所述继代培养纯化菌株的次数为4～6次，优选为5次。在本专利技术中，所述纯化得到的K8菌株的形态学特征为：单细胞，杆状，细胞直径(0.7～0.8)×(3～4)μm，革兰氏染色阳性，芽胞中生，菌落表面粗糙不透明，微黄色，好氧。在本专利技术中，所述K8菌株的核酸序列长度为1480bp。在本专利技术中，所述K8菌株的16srRNA的鉴定方法，包括以下步骤：(1)提取DNA，进行PCR扩增，得到扩增产物；(2)扩增产物纯化后进行16srRNA序列测定，得到K8菌株的16srRNA的序列；(3)将K8菌株的16srRNA的序列进行Blast分析，并采用MEGA7.0的Neighbor-Joining软件，构建得到K8菌株的16srRNA的系统发育树。在本专利技术中，K8菌株与BacillussubtilisNR_112116.2的同源相似性达到100％。本专利技术还提供了一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8的应用，用于去除水体中氨氮、硝态氮和亚硝态氮。在本专利技术中，用于去除水体中氨氮、硝态氮和亚硝态氮时K8菌液的培养基LB细菌培养基。在本专利技术中，用于去除水体中氨氮、硝态氮和亚硝态氮时的K8菌液制备时的培养时间为12～36h，优选为24h。在本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8，其特征在于，所述枯草芽胞杆菌分类为Bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年4月10日，保藏编号为CGMCC No.19558。/n

【技术特征摘要】
1.一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8，其特征在于，所述枯草芽胞杆菌分类为Bacillussubtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年4月10日，保藏编号为CGMCCNo.19558。


2.一种权利要求1所述的一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8的应用，其特征在于，用于去除水体中氨氮、硝态氮和亚硝态氮。


3.一种权利要求1所述的一株...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢凤行，张峰峰，周可，赵琼，孙海波，赵玉洁，
申请(专利权)人：天津市农业科学院，
类型：发明
国别省市：天津;12