一株芽孢杆菌E62及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一株芽孢杆菌E62及其应用，属于水产养殖饲料益生菌添加剂技术领域，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2020018。本发明专利技术通过体内实验验证了分离自大菱鲆肠道的芽孢杆菌E62在大菱鲆幼鱼饲料中的益生效果。芽孢杆菌E62具有改善大菱鲆幼鱼肠道健康，促进其肠道消化吸收，提高其肠道抗氧化能力，增强其肠道黏膜屏障功能，提高其抗病力的优点。

【技术实现步骤摘要】
一株芽孢杆菌E62及其应用
本专利技术属于水产饲料益生菌添加剂
，具体涉及从大菱鲆肠道中分离一株芽孢杆菌E62(Bacillussp.E62)及其在改善大菱鲆幼鱼肠道健康和提高抗病力中的应用。
技术介绍
我国水产养殖产量占世界总产量的70％，是水产养殖大国，并仍处于快速发展中。但与之相矛盾的是鱼粉资源的极度短缺，因此大量的植物蛋白源被广泛的应用在水产饲料中。但植物蛋白源的应用容易引起养殖鱼类尤其是肉食性鱼类的健康问题，这其中肠炎是最主要的问题。肠道是动物重要的消化吸收器官、免疫器官和内分泌器官，是机体内外环境之间信息交流和物质交换的重要场所，健康的肠道对鱼体的生长和健康而言至关重要。所以，肠炎的发生不仅会严重损害肠道健康，例如削弱对营养物质的消化吸收和破坏肠道的抗氧化功能，而且还会降低鱼类的免疫功能和抗病力，严重损害鱼体健康。而高密度的集约化养殖模式是目前及一段时间内主要的水产养殖模式，鱼体健康受到损害后极易引起大规模病害的发生。为了快速消灭病害，许多抗生素曾被滥用于水产养殖中，导致了很多严重的问题，例如细菌耐药性增强、污染环境、危害人体健康等。我国自2020年7月1日起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料。所以，寻找健康无害且绿色环保的抗生素替代品已经成为水产养殖业的热点和难点。由于肠道微生物是在动物生长过程中，与动物机体、环境和食物等相互作用而形成的复杂而动态变化的微生物区系，对保护肠道健康具有重要作用，因此在众多的抗生素替代品中，从动物肠道微生物中筛选分离的益生菌具有诱人的发展前景，其不但符合宿主特异性，更有利于其被摄食后重新粘附于动物肠道中发挥作用。肠道黏膜屏障是维持肠道稳态的主要防御性屏障，而肠道上皮细胞之间的紧密连接是肠道黏膜屏障的重要组成部分。许多研究证明肠道粘膜屏障、肠道菌群和肠炎之间存在着密切的联系，肠道菌群稳态失衡和肠道黏膜屏障的破坏是动物肠炎发生的首要原因。所以调节肠道菌群平衡、增强肠道黏膜屏障功能进而改善肠道健康、提高机体免疫水平是促进鱼类健康养殖的重要保证。许多研究和应用表明，在饲料中添加益生菌，尤其是添加从动物肠道中分离的益生菌，可以通过帮助宿主消化吸收营养物质、改善肠道黏膜屏障功能、降低肠腔内的pH值、促进有益菌的粘附、竞争性排斥致病菌、分泌抗菌物质、调节肠道和机体免疫系统等发挥其益生作用。目前常用的益生菌主要包括乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌等，而芽孢杆菌由于其能产生芽孢，具有较强的抗逆性，是比较理想的益生菌。因此，目前水产养殖业急需分离和筛选出能保护肠道健康和增强抗病力的芽孢杆菌，使其以饲料益生菌添加剂的形式调节肠道菌群结构、增强肠道的消化吸收和抗氧化能力、增强肠道黏膜屏障功能，保证肠道的健康以及提高抗病力。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一株芽孢杆菌E62及其应用，本专利技术菌株在应用后能够改善大菱鲆的肠道菌群，促进肠道健康，提高大菱鲆的消化吸收和抗氧化能力，增强肠道黏膜屏障功能，提高免疫力和抗病力，从而保护了鱼体健康。本专利技术是通过如下技术方案来实现的：一株芽孢杆菌E62，该菌株已于2020年1月7日保藏在中国典型培养物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection，简称CCTCC)，保藏号为CCTCCM2020018。进一步，所述芽孢杆菌E62的16SrDNA序列见SEQNO.1。本专利技术还提供所述芽孢杆菌E62在大菱鲆幼鱼饲料中的应用。本专利技术还提供一种含有所述芽孢杆菌E62的大菱鲆幼鱼饲料，其中所述的芽孢杆菌E62的活菌数为1×108CFU/g饲料。本专利技术还提供所述芽孢杆菌E62在制备改善大菱鲆幼鱼肠道健康微生态制剂中的应用。一种含有所述芽孢杆菌E62的微生态制剂。本专利技术与现有技术相比的有益效果：本专利技术通过体内实验验证了分离自大菱鲆肠道的芽孢杆菌E62在大菱鲆幼鱼饲料中的益生效果。芽孢杆菌E62具有改善大菱鲆幼鱼肠道健康，促进其肠道消化吸收，提高其肠道抗氧化能力，增强其肠道黏膜屏障功能，提高其抗病力等优点。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但本专利技术的保护范围不受实施例任何形式上的限制。实施例1芽孢杆菌E62的分离和分子鉴定在无菌操作条件下收集大菱鲆新鲜肠道样品，挤出肠道内容物，用无菌PBS把肠道冲洗干净。在无菌匀浆器中加入适量的无菌PBS，将样品放入其中进行匀浆，匀浆液在80℃水浴10min。利用无菌PBS把得到的肠道匀浆液按1:10的比例进行梯度稀释，分别取100μl各浓度梯度的肠道匀浆液，分别均匀涂布于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基，28℃培养，待平板上长出单菌落后，用接种环挑取单菌落进行划线以纯化菌株。挑取纯化后的单菌落到胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基中，28℃200rpm培养18h。取适量该菌液，提取细菌基因组DNA后，用16SrDNA全长引物27F和1492R扩增该菌株的16SrDNA全长。PCR反应体系：PremixTaq(ExTaqVersion2.0plusdye)12.5μl，基因组DNA1μl，ddH2O9.5μl，Forwardprimer1μl，Reverseprimer1μl。PCR程序：98℃10s，55℃30s，72℃2min，共30个循环；72℃10min。PCR产物送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将获得的16SrDNA全长序列在www.ezbiocloud.net网站上进行比对，初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillussp.)，将其编号为E62。芽孢杆菌E62(Bacillussp.E62)于2020年1月7日保藏在中国典型培养物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection，简称CCTCC)，保藏号为CCTCCM2020018，16SrDNA序列：cgagcggattgatgggagcttgctcccatcagtcagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggataactcatttcctcgcatgaggaaatgttgaaaggtggcttttagctatcacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcgg本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株芽孢杆菌E62，其特征在于该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2020018。/n

【技术特征摘要】
1.一株芽孢杆菌E62，其特征在于该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2020018。


2.根据权利要求1所述的一株芽孢杆菌E62，其特征在于所述芽孢杆菌E62的16SrDNA序列见SEQNO.1。


3.权利要求1所述的一株芽孢杆菌E62在大菱鲆幼鱼饲料中的应用。...

【专利技术属性】
技术研发人员：张彦娇，欧伟豪，赵思帆，艾庆辉，张文兵，麦康森，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37