一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器及其制备方法，利用聚吡咯还原氧化石墨烯复合物(PPy‑rGO)纳米复合材料及亲和素‑辣根过氧化物酶(SA‑HRP)修饰的金纳米粒子(AuNPs)成功制备了一种基于双重信号放大超灵敏检测食品中沙门氏菌的DNA电化学传感器。该DNA电化学传感器具有快速、灵敏、低耗低成本特点，可用于食品中的沙门氏菌检测。因此，该生物传感器可通过invA基因对食品中沙门氏菌进行检测，应用前景广泛，是制造电化学DNA生物传感器的理想模式。

【技术实现步骤摘要】
一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器及其制备方法
本专利技术涉及到微生物检测领域，具体说是一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器及其制备方法。
技术介绍
DNA生物传感器以核酸作为分子识别元件，将目标物的存在转换为可检测的电、光、声等信号，其包含两部分即分子识别元件和换能器。分子识别元件用来感知待测样品中是否存在目标物质及含量，DNA生物传感器分子识别元件通常是一段被固定在修饰电极上的单链DNA杂交形成双链DNA，或识别小分子物质形成特异结构。换能器将探针与目标物杂交前后所产生的变化转换为可被分析测量的信号(电流、频率变化、荧光和光吸收的强度等)，根据信号的变化量，定性定量检测DNA或小分子物质。DNA生物传感器中用于生物识别的DNA分子易于合成、稳定性高、可再生、有易于功能化修饰与标记等优点。DNA生物传感器按换能器不同分为光学DNA传感器、压电DNA传感器、电化学DNA传感器等。目前检测食品中沙门氏菌的的生物传感器有荧光传感器、磁电传感器、电容免疫传感器、压电免疫传感器、电化学免疫传感器等。这些生物传感器在沙门氏菌检测中存在选择性差、检测周期长、检测灵敏度低及检测成本高等问题。因此研究开发快速、灵敏、低耗低成本、易于操作和便携等优点的新型食品中沙门氏菌DNA生物传感器很有必要。
技术实现思路
本专利技术利用聚吡咯还原氧化石墨烯复合物(PPy-rGO)纳米复合材料及亲和素-辣根过氧化物酶(SA-HRP)修饰的金纳米粒子(AuNPs)成功制备了一种基于双重信号放大超灵敏检测食品中沙门氏菌的DNA电化学传感器。该DNA电化学传感器具有快速、灵敏、低耗低成本特点，可用于食品中的沙门氏菌检测。一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：(1)电极预处理；(2)电极组装；首先，滴加5-6μL浓度为1.0mg/mL-1的聚吡咯-还原氧化石墨烯PPy-rGO溶液到预处理后的电极表面，将电极置于干燥器中，静置1.8-2.2h，获得聚吡咯-还原氧化石墨烯修饰电极PPy-rGO/GCE；将聚吡咯-还原氧化石墨烯修饰电极PPy-rGO/GCE置于浓度为3-4mM的HAuCl4与浓度为0.1MKNO3的混合溶液中，在恒定电位-0.2V下电沉积50-55s，用超纯水洗涤电极，用N2吹干，得到金纳米粒子修饰后电极depAuNP/PPy-rGO/GCE；用移液器取5-6μL的10μMcDNA滴加到所得电极表面，放置11-12小时，之后电极依次用浓度0.1％的SDS溶液和pH7.4的10mM的Tris-HCl缓冲液洗去未结合在电极表面的探针，待电极表面干燥后滴加浓度2％的BSA溶液100-110μL，放置58-62min以消除非特异性吸附，得到的DNA传感界面BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE电极；将100-110μL浓度为100pM的tDNA与10-11μL的浓度为10μM的bio-DNA溶液混合均匀，将上述DNA传感界面BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE电极浸泡在此溶液中，36-38℃下温育1-1.1h，得到bio-DNA/tDNA/BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE电极；之后再在所得电极上滴加亲和素-辣根过氧化物酶修饰的金纳米粒子AuNPs-HRP-SA复合物5-6μL，室温下放置30-32min，Tris-HCl缓冲液清洗并用N2吹干得到AuNPs-HRP-SA/bio-DNA/tDNA/BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE，即得。所述的一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于：所述的电极预处理方法为：首先将直径为3mm的玻碳电极先用1200目SiC砂纸打磨1-2min，再依次用1.0、0.3和0.05μm的Al2O3抛光至镜面；再依次用1:1的硝酸水溶液、1:1的乙醇和超纯水超声清洗3-4min；以5mMFe(CN)63-/4-溶液为底液，将电极在-0.2～0.6V范围内循环伏安获得一对可逆氧化还原峰，当峰差小于80mV时，说明电极表面清洁可用，否则重新处理电极，直到电极符合要求，最后用二次蒸馏水清洗再用氮气吹干。所述的一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于：浓度为1.0mgmL-1聚吡咯-还原氧化石墨烯PPy-rGO溶液制备方法包括以下步骤：(1)准确称取0.100g的氧化石墨烯溶解于100mL超纯水中，配置浓度为1.0mg/mL-1的氧化石墨烯悬浊液，超声23-24h，悬浊液变为较均匀溶液，转速3000-3100rpm离心10-12min，取上清液，得到均一稳定的溶液，再用超纯水透析1周，去除其它小分子，最终得到1.0mg/mL-1氧化石墨烯溶液；(2)取10-12mL1.0mg/mL-1氧化石墨烯溶液于锥形瓶中，匀速搅拌下加入150μLPy:GO质量比为15:1的吡咯，超声25-30min，将浓度为1molL-1FeCl3溶液一滴一滴加入到溶液中，使得nFe3+:nPy＝1:1，室温下搅拌23-24h，原位聚合得到PPy-GO复合物，用乙醇和超纯水离心洗涤三次，真空干燥得到固体粉末；(3)利用所得固体粉末配置10mL1.0mg/mL-1PPy-GO溶液，随后缓慢加入100μL浓度为28％的氨水，最后加入40μL浓度为25％的水合肼，将混合物剧烈搅拌25-30min，然后在55-60℃下中速搅拌反应15-16h，得到的黑色溶液，10000-11000rpm下离心25-30min，弃去上清液，并将沉淀离心水洗3-4次，之后将得到的PPy-rGO真空干燥，制备浓度为1.0mgmL-1PPy-rGO溶液，3-4℃下储存备用，即得。所述的一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于：亲和素-辣根过氧化物酶修饰的金纳米粒子AuNPs-HRP-SA复合物的制备方法为：(1)用锥形瓶取100mL浓度为0.01％的氯金酸溶液置于石棉网加热至沸腾，加入3.5mL浓度1％柠檬酸钠，迅速搅拌，继续加热直至溶液颜色由浅黄色变为紫色，最后变为酒红色，停止加热，待溶液冷却，将制备好的金纳米粒子AuNPs溶液置于3-5℃冰箱备用；(2)取1mL制备好的AuNPs溶液于1.5mL离心管中，10000-11000rpm下离心10-12min，弃去上清液，用pH7.4的PBS缓冲液重新定容至300μL，完成AuNPs溶液的浓缩，加入20μL浓度0.1mg/mL-1SA-HRP溶液，震荡均匀，3-5℃放置23-25h，之后转速7500-8000rpm条件下离心15-20min，离心水洗三次后用缓冲液定容，3-4℃条件下储存备用，得到亲和素-辣根过氧化物酶修饰的金纳米粒子AuNPs-HRP-SA复合物。所述的一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于：Tris-HCl缓冲液溶液的制备方法为:准确称取0.484g的T本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于：/n其制备方法包括以下步骤：/n(1)电极预处理；/n(2)电极组装；/n首先，滴加5-6μL浓度为1.0mg/mL-1的聚吡咯-还原氧化石墨烯PPy-rGO溶液到预处理后的电极表面，将电极置于干燥器中，静置1.8-2.2h，获得聚吡咯-还原氧化石墨烯修饰电极PPy-rGO/GCE；/n将聚吡咯-还原氧化石墨烯修饰电极PPy-rGO/GCE置于浓度为3-4mM的HAuCl

【技术特征摘要】
1.一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于：
其制备方法包括以下步骤：
(1)电极预处理；
(2)电极组装；
首先，滴加5-6μL浓度为1.0mg/mL-1的聚吡咯-还原氧化石墨烯PPy-rGO溶液到预处理后的电极表面，将电极置于干燥器中，静置1.8-2.2h，获得聚吡咯-还原氧化石墨烯修饰电极PPy-rGO/GCE；
将聚吡咯-还原氧化石墨烯修饰电极PPy-rGO/GCE置于浓度为3-4mM的HAuCl4与浓度为0.1MKNO3的混合溶液中，在恒定电位-0.2V下电沉积50-55s，用超纯水洗涤电极，用N2吹干，得到金纳米粒子修饰后电极depAuNP/PPy-rGO/GCE；用移液器取5-6μL的10μMcDNA滴加到所得电极表面，放置11-12小时，之后电极依次用浓度0.1％的SDS溶液和pH7.4的10mM的Tris-HCl缓冲液洗去未结合在电极表面的探针，待电极表面干燥后滴加浓度2％的BSA溶液100-110μL，放置58-62min以消除非特异性吸附，得到的DNA传感界面BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE电极；
将100-110μL浓度为100pM的tDNA与10-11μL的浓度为10μM的bio-DNA溶液混合均匀，将上述DNA传感界面BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE电极浸泡在此溶液中，36-38℃下温育1-1.1h，得到bio-DNA/tDNA/BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE电极；
之后再在所得电极上滴加亲和素-辣根过氧化物酶修饰的金纳米粒子AuNPs-HRP-SA复合物5-6μL，室温下放置30-32min，Tris-HCl缓冲液清洗并用N2吹干得到AuNPs-HRP-SA/bio-DNA/tDNA/BSA/cDNA/depAuNP/PPy-rGO/GCE，即得。


2.根据权利要求1所述的一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于：所述的电极预处理方法为：首先将直径为3mm的玻碳电极先用1200目SiC砂纸打磨1-2min，再依次用1.0、0.3和0.05μm的Al2O3抛光至镜面；再依次用1:1的硝酸水溶液、1:1的乙醇和超纯水超声清洗3-4min；以5mMFe(CN)63-/4-溶液为底液，将电极在-0.2～0.6V范围内循环伏安获得一对可逆氧化还原峰，当峰差小于80mV时，说明电极表面清洁可用，否则重新处理电极，直到电极符合要求，最后用二次蒸馏水清洗再用氮气吹干。


3.根据权利要求1所述的一种用于沙门氏菌检测的DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于：
浓度为1.0mgmL-1聚吡咯-还原氧化石墨烯PPy-rGO溶液制备方法包括以下步骤：
(1)准确称取0.100g的氧化石墨烯溶解于100mL超纯水中，配置浓度为1.0mg/mL-1的氧化石墨烯悬浊液，超声23-24h，悬浊液变为较均匀溶液，转速3000-3100rpm离心10-12min，取...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑海松，叶永康，孙娟娟，李云飞，宗凯，余晓峰，
申请(专利权)人：合肥海关技术中心，
类型：发明
国别省市：安徽;34