一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统及其制备和使用方法技术方案

本方案公开了蛋白的检测技术领域中的一种用于KIM‑1蛋白的无酶电化学免疫检测系统，包括：上层复合物：所述上层复合物为PdPtBP介孔合金纳米颗粒与Ti

【技术实现步骤摘要】
一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统及其制备和使用方法
本专利技术属于蛋白的检测
，特别涉及一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统及其制备和使用方法。
技术介绍
急性肾损伤(Acutekidneyinjury,AKI)是一种治疗成本高、死亡率高的临床住院疾病。目前，AKI的标准诊断工具是监测尿量和血清肌酐(sCr)。然而，两者都是肾功能的标志物，而不是肾脏损伤的标志物。此外，因为尿量和sCr容易受到肌肉质量、年龄、性别和饮食等因素的影响，从而限制了尿量和sCr在诊断AKI方面的应用。最近的证据表明，尿肾损伤分子-1(Kidneyinjurymolecule-1,KIM-1)蛋白是AKI的一个潜在标志物，可快速、无创地反映肾脏损伤和恢复过程。因此，开发可靠、灵敏度高的KIM-1蛋白检测方法对临床诊断和治疗具有重要意义。酶联免疫吸附试验(ELISA)是用于检测KIM-1蛋白的主要方法，还有一些其他基于小众技术平台的检测方法，包括表面等离子体共振成像(SPRi)和Luminex。然而，这些技术在实践中仍面临许多挑战，例如需要复杂、昂贵的仪器，检测灵敏度低，使用昂贵的生物酶等。传统的电化学免疫检测系统大多需要生物酶作为催化剂，其存在不稳定、易失活的缺点，很难在保证生物酶活性的同时实现信号级联放大。因此，发展一种灵敏度高、特异性好、重复性好、检测成本低的无酶电化学免疫检测方法，可以有效扩大KIM-1在临床检验诊断中的应用范围，对AKI的早期诊断和治疗具有较大意义。专利技术内容鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统，用于解决现有技术中检测成本高，操作复杂，灵敏度低，特异性差等问题。本方案中的一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统，包括：上层复合物：所述上层复合物为PdPtBP介孔合金纳米颗粒与Ti3C2TXMXene分散液结合制成的PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物，所述PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物上结合有标记抗体；下层复合物：所述下层复合物为修饰后的电极，所述修饰后的电极为利用CuCl2纳米线和金纳米颗粒修饰的电极，所述修饰后的电极上结合有捕获抗体；检测体系：所述检测体系为含有H2O2的PBS溶液。进一步，所述含有H2O2的PBS溶液中H2O2的浓度为4mmol/L。制备一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统的方法，包括以下步骤：步骤一、上层复合物的制备：(1)合成PdPtBP介孔合金纳米颗粒溶液：称取120mg的双十八烷基二甲基氯化铵在40mL去离子水中充分溶解得到悬液；然后，将浓度为0.337mol/L的NH4F溶液4mL、浓度为0.101mol/L的H3BO3溶液4mL、浓度为10mmol/L的H2PdCl4溶液2.56mL、浓度为10mmol/L的H2PtCl6溶液0.64mL加入到上述悬液中；混匀后于30℃孵育5分钟，加入1.6mLNH3·H2O溶液(10wt.％)混匀；再加入0.034mol/L的NaH2PO2·H2O溶液4mL，将混合物从30℃加热到95℃，并在95℃下保持20分钟，同时搅拌；最后，加入0.1mol/L新鲜制备的二甲胺基硼烷4mL，搅拌至混合物由白色完全变为深褐色后，在95℃的温度下保持30分钟后冷却至室温；离心收集深色产物，用体积比为1:1的乙醇/水洗涤3次，将产物分散在4mL去离子水中；(2)准备聚多巴胺/Ti3C2TXMXene分散液：对Ti3C2TXMXene分散液进行1.5小时的超声处理，2000rpm离心5分钟，收集上清液0.5mL；将取得的上清液分散于5mL去离子水中，然后调至pH8.0～9.0，缓慢加入1.0mg盐酸多巴胺，用磁力搅拌24小时，离心取沉淀，再用去离子水洗涤三次，得到聚多巴胺功能化的二维Ti3C2TXMXene纳米复合物，将其溶解于1.5mL去离子水中得到均相溶液；(3)将1mL上述步骤一(1)中合成的PdPtBP介孔合金纳米颗粒溶液滴入上述步骤一(2)中的均相溶液中，磁力搅拌10～14h后，5000rpm离心5分钟，沉积物即为PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物，将其溶解于1.5mL去离子水中得到PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物均相溶液，并于4℃保存备用；(4)、在PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物上结合标记抗体：取步骤一(3)合成的PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物均相溶液1mL，与1mL浓度为10μmol/L的标记抗体混合，在4℃下搅拌10～14h；离心丢弃未结合的标记抗体后，加入牛血清白蛋白阻断非特异性位点，然后进行离心取沉淀，在4℃条件下分散在1mLPBS溶液中即得上层复合物，备用；步骤二、下层复合物的制备：(1)准备电极、CuCl2纳米线溶液和1.0wt％的HAuCl4溶液，将CuCl2纳米线溶液滴在电极上，37℃烘干，然后置于1.0wt％HAuCl4溶液中，在-0.2V恒电势下作用30s，电沉积金后，采用去离子水清洗并室温干燥得到修饰后的电极；其中，CuCl2纳米线溶液的制备是：将CuCl20.05g、硫脲0.05g和乙醇40mL加入到体积为50mL的瓶中，封瓶后，混合均匀，在室温下超声搅拌5分钟；离心收集白色产物为CuCl2纳米线，用水冲洗2次；称取CuCl2纳米线，然后将其溶解在30mL去离子水中既得CuCl2纳米线溶液；(2)在步骤二(1)所述修饰后的电极表面滴加10μL浓度为10μg/mL的捕获抗体，37℃孵育1小时；然后用10μL浓度为10mg/mL的BSA溶液在37℃下封闭1小时；最后，用pH为7.4，浓度为0.01mmol/LPBS溶液冲洗即得所述下层复合物，并保存于4℃备用。进一步，一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统的制备方法，步骤二(1)中，在将CuCl2纳米线溶液滴在电极之前，先用铝粉对电极抛光10分钟，然后经去离子水超声波清洗后，用氮气冲洗，最后干燥。一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统的使用方法，包括以下步骤：步骤一、取8μL不同浓度的KIM-1蛋白溶液滴于所述下层复合物的表面，在37℃孵育1小时后用0.01mmol/L的PBS冲洗，得到捕获了KIM-1蛋白的下层复合物；步骤二、取所述上层复合物在37℃下滴于捕获了KIM-1蛋白的下层复合物表面，孵育1小时后用0.01mmol/L的PBS冲洗；然后于含有4mmol/L的H2O2的PBS溶液中使用电化学输出方法进行信号的输出。进一步，一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统的使用方法中，步骤二所述电化学输出方法为差分脉冲伏安法或方波伏安法或电流时间法。介孔纳米粒子(Mesoporousnanoparticles,MNPs)比其本体纳米粒子表现出更好的催化性能，因为它们具有更大的表面积和可接近的介孔。此外，合金化贵金属可以改变表面电子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统，其特征在于：包括：/n上层复合物：所述上层复合物为PdPtBP介孔合金纳米颗粒与Ti

【技术特征摘要】
1.一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统，其特征在于：包括：
上层复合物：所述上层复合物为PdPtBP介孔合金纳米颗粒与Ti3C2TXMXene分散液结合制成的PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物，所述PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物上结合有标记抗体；
下层复合物：所述下层复合物为修饰后的电极，所述修饰后的电极为利用CuCl2纳米线和金纳米颗粒修饰的电极，所述修饰后的电极上结合有捕获抗体；
检测体系：所述检测体系为含有H2O2的PBS溶液。


2.根据权利要求1所述的一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统，其特征在于：所述含有H2O2的PBS溶液中H2O2的浓度为4mmol/L。


3.制备如权利要求2所述的一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、上层复合物的制备：
(1)合成PdPtBP介孔合金纳米颗粒溶液：称取120mg的双十八烷基二甲基氯化铵在40mL去离子水中充分溶解得到悬液；然后，将浓度为0.337mol/L的NH4F溶液4mL、浓度为0.101mol/L的H3BO3溶液4mL、浓度为10mmol/L的H2PdCl4溶液2.56mL、浓度为10mmol/L的H2PtCl6溶液0.64mL加入到上述悬液中；混匀后于30℃孵育5分钟，加入1.6mLNH3·H2O溶液(10wt.％)混匀；再加入0.034mol/L的NaH2PO2·H2O溶液4mL，将混合物从30℃加热到95℃，并在95℃下保持20分钟，同时搅拌；最后，加入0.1mol/L新鲜制备的二甲胺基硼烷4mL，搅拌至混合物由白色完全变为深褐色后，在95℃的温度下保持30分钟后冷却至室温；离心收集深色产物，用体积比为1:1的乙醇/水洗涤3次，将产物分散在4mL去离子水中；
(2)准备聚多巴胺/Ti3C2TXMXene分散液：对Ti3C2TXMXene分散液进行1.5小时的超声处理，2000rpm离心5分钟，收集上清液0.5mL；将取得的上清液分散于5mL去离子水中，然后调至pH8.0～9.0，缓慢加入1.0mg盐酸多巴胺，用磁力搅拌24小时，离心取沉淀，再用去离子水洗涤三次，得到聚多巴胺功能化的二维Ti3C2TXMXene纳米复合物，将其溶解于1.5mL去离子水中得到均相溶液；
(3)将1mL上述步骤一(1)中合成的PdPtBP介孔合金纳米颗粒溶液滴入上述步骤一(2)中的均相溶液中，磁力搅拌10～14h后，5000rpm离心5分钟，沉积物即为PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物，将其溶解于1.5m...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘长金，丁世家，文静，闵迅，韩道滨，
申请(专利权)人：遵义医科大学附属医院，
类型：发明
国别省市：贵州;52