检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的方法及所用引物组合物技术

本发明专利技术公开了一种以MAS‑PCR技术检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性的方法及其所用引物组合物。所述引物组合物中的特异性引物D95E‑R、H105R‑R、G109V‑R分别为针对抗啶酰菌胺的多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基突变位点D95E、H105R和G109V设计的反向引物，对应的序列在突变位点处，且对3’端碱基进行特殊的设计，提高了引物的特异性。本发明专利技术检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性的方法可以在一个PCR反应管中同时检测出D95E、H105R和G109V 3种突变类型，相比较其他只能检测单一突变的检测方法，该方法具有省时，省力，快速，高通量的优点，可准确检测大量样品。

【技术实现步骤摘要】
检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的方法及所用引物组合物
本专利技术涉及植物保护和生物
中一种检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的方法及所用引物组合物。
技术介绍
由多主棒孢菌(Corynesporacassiicoa)引起的黄瓜棒孢叶斑病是果蔬上一种非常普遍的病害，且危害十分严重，给果蔬生产造成了巨大的损失。黄瓜棒孢叶斑病一般田间发病率为10％-25％，严重时可达60％-70％，甚至100％。目前防治该病害仍然主要依赖于杀菌剂。琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHI)类杀菌剂是生产上现在使用较多的一类杀菌剂。但由于其大量使用，多主棒孢菌已对其产生了抗药性，而该药的防治效果也随之大幅度下降。对抗性菌株进行研究发现，抗性菌株的琥珀酸脱氢酶B、C、D亚基发生了点突变。研究发现主要的抗性突变类型有：SdhB-H278R/Y,SdhB-I280V,SdhC-S73P,SdhD-G109V,SdhD-H105R,SdhD-D95E,SdhD-S89P，且琥珀酸脱氢酶B、C和D亚基上不同的点突变分别对应不同的抗性水平。其中，SdhD-G109V，SdhD-H105R和SdhD-D95E这三种多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变均导致多主棒孢菌对啶酰菌胺产生抗药性。在我国仅公开号为CN107299147A的中国专利文献公开了一种检测多主棒孢菌SdhB-I280V点突变的AS-PCR检测方法，而SdhD-D95E，SdhD-G109V和SdhD-H105R点突变的检测体系上尚没有建立。申请人从2018年到2020年对田间采集的黄瓜棒孢叶斑病样品进行抗药性监测，发现SdhD-D95E和SdhD-G109V两种突变类型的菌株在田间的比例呈现上升的趋势，因此需要建立一种检测由点突变导致多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性的方法，该检测方法的建立对病害的有效防治和农药的合理使用有指导意义，同时也为抗药性管理策略的指定提供知道性意见。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何快速检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的引物组合物。本专利技术所提供的检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的引物组合物，所述琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型为SdhD-G109V，SdhD-H105R和SdhD-D95E这三种氨基酸点突变，所述引物组合物由MAS-R、MAS-F、D95E-R、H105R-R和G109V-R组成，所述MAS-F为对应于野生型多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基的MAS-PCR上游引物，所述MAS-R为对应于野生型多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基的一条MAS-PCR下游引物，所述D95E-R为对应于多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基上SdhD-D95E突变的一条MAS-PCR下游引物，所述H105R-R为对应于多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基上SdhD-H105R突变的一条MAS-PCR下游引物，所述G109V-R为对应于多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基上SdhD-G109V突变的一条MAS-PCR下游引物。上述引物组合物中，所述MAS-F是核苷酸序列为序列表中序列1的单链DNA，所述MAS-R是核苷酸序列为序列表中序列2的单链DNA，所述D95E-R是核苷酸序列为序列表中序列3的单链DNA，所述H105R-R是核苷酸序列为序列表中序列4的单链DNA，所述G109V-R是核苷酸序列为序列表中序列5的单链DNA。所述引物组合物中，所述MAS-F、所述MAS-R、所述D95E-R、所述H105R-R和G109V-R的摩尔比为1：1：1：1：1。所述MAS-F、所述MAS-R、所述D95E-R、所述H105R-R和G109V-R可分别单独包装，也可组合在一起。为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的的试剂或试剂盒。本专利技术所提供的检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的的试剂或试剂盒，包括上述检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的引物组合物。上述检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的引物组合物在检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性中的应用或在制备检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性产品中的应用也属于本专利技术的保护范围。所述SDHI杀菌剂可为啶酰菌胺、氟吡菌酰胺、吡噻菌胺、萎锈灵等琥珀酸脱氢酶类杀菌剂。上述检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的的试剂或试剂盒在检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性中的应用或在制备检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性产品中的应用也属于本专利技术的保护范围。所述SDHI杀菌剂可为啶酰菌胺,氟吡菌酰胺、吡噻菌胺、萎锈灵等琥珀酸脱氢酶类杀菌剂。为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的方法，包括以待鉴别多主棒孢菌的基因组DNA为模板，用所述引物组合物进行MAS-PCR扩增得到MAS-PCR产物，检测所述MAS-PCR产物的大小，如果所述MAS-PCR产物为大于400bp至小于500bp的一个DNA片段，则所述待鉴别多主棒孢菌不具有琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型；如果所述MAS-PCR产物除了所述大于400bp至小于500bp的一个DNA片段之外，还有大于200bp至小于250bp的DNA片段，则所述待鉴别多主棒孢菌具有琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型；所述琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型为SdhD-G109V，SdhD-H105R和/或SdhD-D95E这三种氨基酸点突变。上述检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的方法中，所述大于400bp至小于500bp的一个DNA片段具体可为大小为460-490bp的一个DNA片段(如大小为479bp的一个DNA片段)。上述检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的方法中，所述大于200bp至小于250bp的DNA片段含有大于200bp至小于210bp的一个DNA片段(如大小为203bp的一个DNA片段)，所述待鉴别多主棒孢菌具有SdhD-D95E这种琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型；所述大于200bp至小于250bp的DNA片段含有大于230bp至小于240bp的一个DNA片段(如大小为233bp的一个DNA片段)，所述待鉴别多主棒孢菌具有SdhD-H105R这种琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型；所述大于200bp至小于250bp的DNA片段含有大于240bp至小于250bp的一个DNA片段(如大小为245bp的一个DNA片段)，所述待鉴别多主棒孢菌具有SdhD-G109V这种琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型。上述检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的方法中，所述待鉴别多主棒孢菌可为侵染黄瓜造成黄瓜棒孢叶斑病的多主棒孢菌。为了解决上述技术问题，本专利技术还提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的引物组合物，其特征在于：所述琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型为SdhD-G109V，SdhD-H105R和SdhD-D95E这三种氨基酸点突变，所述引物组合物由MAS-R、MAS-F、D95E-R、H105R-R和G109V-R组成，所述MAS-F为对应于野生型多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基的MAS-PCR上游引物，所述MAS-R为对应于野生型多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基的一条MAS-PCR下游引物，所述D95E-R为对应于多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基上SdhD-D95E突变的一条MAS-PCR下游引物，所述H105R-R为对应于多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基上SdhD-H105R突变的一条MAS-PCR下游引物，所述G109V-R为对应于多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基上SdhD-G109V突变的一条MAS-PCR下游引物。/n

【技术特征摘要】
1.检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的引物组合物，其特征在于：所述琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型为SdhD-G109V，SdhD-H105R和SdhD-D95E这三种氨基酸点突变，所述引物组合物由MAS-R、MAS-F、D95E-R、H105R-R和G109V-R组成，所述MAS-F为对应于野生型多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基的MAS-PCR上游引物，所述MAS-R为对应于野生型多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基的一条MAS-PCR下游引物，所述D95E-R为对应于多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基上SdhD-D95E突变的一条MAS-PCR下游引物，所述H105R-R为对应于多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基上SdhD-H105R突变的一条MAS-PCR下游引物，所述G109V-R为对应于多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基上SdhD-G109V突变的一条MAS-PCR下游引物。


2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于：所述MAS-F是核苷酸序列为序列表中序列1的单链DNA，所述MAS-R是核苷酸序列为序列表中序列2的单链DNA，所述D95E-R是核苷酸序列为序列表中序列3的单链DNA，所述H105R-R是核苷酸序列为序列表中序列4的单链DNA，所述G109V-R是核苷酸序列为序列表中序列5的单链DNA。


3.检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组合物；所述琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型为SdhD-G109V，SdhD-H105R和SdhD-D95E这三种氨基酸点突变。


4.权利要求1或2所述的引物组合物在检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性中的应用或在制备检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性产品中的应用。


5.权利要求3所述的试剂或试剂盒在检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性中的应用或在制备检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性产品中的应用。


6.检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的方法，其特征在于，所述方法包括以待鉴别多主棒孢菌的基因组DNA为模板，用权利要求1或2所述引物组合物进行MAS-PCR扩增得到MAS-PCR产物，检测所述MAS-PCR产物的大小，如果所述MAS-PCR产物为大于400bp至小于500bp的一个DNA片段，则所...

【专利技术属性】
技术研发人员：石延霞，李宝聚，孙炳学，谢学文，柴阿丽，李磊，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11