基于CRISPR技术进行靶核酸检测的方法技术

本发明专利技术提供了基于CRISPR技术进行靶核酸检测的方法，具体地，提供了一种基于CRISPR技术检测靶核酸的方法、系统和试剂盒，所述的检测方法包括向含有靶核酸的反应体系中加入gRNA、Cas蛋白和单链核酸检测器，所述单链核酸检测器可以为单链DNA、单链RNA或者单链DNA‑RNA杂交体。

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR技术进行靶核酸检测的方法
本专利技术涉及核酸检测领域，涉及基于CRISPR技术进行靶核酸检测的方法，尤其涉及基于CRISPR技术进行靶核酸检测的方法、系统和试剂盒。
技术介绍
特异性检测核酸分子(Nucleicaciddetection)方法具有重要的应用价值，例如病原体的检测，遗传病检测等。在病原体检测方面，由于每种病原体微生物都有其独一无二的特征核酸分子序列，因此可以开发出针对特定物种的核酸分子检测，也称为核酸诊断(NADs,nucleicaciddiagnostics)，在食品安全、环境微生物污染检测，人体病原菌感染等领域具有重要义。另一个方面是对人或其他物种的单核苷酸多态性(SNPs,singlenucleotidepolymorphisms)的检测。在基因组水平上去理解遗传变异和生物学功能之间的关系为现代分子生物学提供了新视角，而其中SNPs对生物学的功能、进化和疾病等密切相关，因此SNPs的检测与分析技术的发展尤为重要。目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。现有检测技术包括限制性核酸内切酶方法、Southern、Northern、斑点杂交、荧光PCR检测技术、LAMP环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)等方法。2012年之后，CRISPR基因编辑技术兴起，张锋团队基于RPA技术开发了一种以Cas13为核心的靶向RNA的新核酸诊断技术(SHERLOCK技术)，Doudna团队开发了一种以Cas12酶为核心的诊断技术(DETECTR技术),中国科学院上海植物生理生态研究所王金博士等也开发了一种基于Cas12的新型核酸检测技术(HOLMES技术)。基于CRISPR技术开发的核酸检测技术正在日益发挥重要作用。尽管现有核酸检测技术众多，如何更加快速、简便、廉价、精确的检测仍然是改进检测技术的重要方向。因此，开发新型检测体系和检测方法在核酸检测领域仍具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于CRISPR技术进行靶核酸检测的方法、系统和试剂盒。一方面，本专利技术提供了一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列；检测由CRISPR/CAS效应蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸。另一方面，本专利技术还提供了一种用于检测样品中靶核酸的系统或组合物，所述系统或组合物包括V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列。另一方面，本专利技术还提供了一种用于检测样品中靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包括V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列。另一方面，本专利技术还提供了上述系统或试剂盒在检测样品中靶核酸的应用。另一方面，本专利技术还提供了V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白在检测样品中靶核酸中的应用。如上所述的应用，所述V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白在与样品中的靶核酸结合或杂交后，可以切割体系中的单链核酸检测器。另一方面，本专利技术还提供了V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白在制备检测样品中靶核酸的试剂中的应用。进一步的，所述V型CRISPR/CAS效应蛋白选自Cas12、Cas14家族蛋白或其突变体，所述VI型CRISPR/CAS效应蛋白包括Cas13家族蛋白或其突变体。在一个实施方式中，所述Cas蛋白优选为Cas12家族，包括但不限于Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j中的一种或任意几种。在一个实施方式中，所述Cas12a选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a中一种或任意几种；所述Cas12a优选为LbCas12a，氨基酸序列如SEQIDNo.5所示，或者，将SEQIDNo.5所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。在其他的实施方式中，所述Cas12b的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示，或者，将SEQIDNo.6所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。在一个实施方式中，所述Cas13家族蛋白包括Cas13a、Cas13b，优选的，所述Cas13a选自Lshcas13a，其氨基酸序列如SEQIDNo.7所示，或者，将SEQIDNo.7所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。在优选的实施方式中，所述Cas12i蛋白的氨基酸序列选自下组：(1)SEQIDNO：2所示的蛋白；(2)将SEQIDNO：2所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。所述Cas12j蛋白的氨基酸序列选自下组：(1)SEQIDNO：4所示的蛋白；(2)将SEQIDNO：4所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。在一个实施方式中，所述Cas蛋白突变体包括氨基酸取代、缺失或替换，且所述突变体至少保留其trans切割活性。优选地，所述突变体具有Cis和trans切割活性。本专利技术中，所述靶核酸包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，包括单链核酸、双链核酸，例如单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA。本专利技术中，所述单链核酸检测器包括单链DNA、单链RNA或者单链DNA-RNA杂交体。在其他的实施方式中，所述单链核酸检测器包括单链DNA、单链RNA或者单链DNA-RNA杂交体的任意两种或三种的混合物，例如，单链DNA和单链RNA的组合物、单链DNA和单链DNA-RNA杂交体的组合物、单链RNA和单链DNA-RNA的组合物。在优选的实施方式中，所述单链核酸检测器为单链寡核酸检测器。所述单链核酸检测器不与所述gRNA杂交。在一个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与V型或VI型Cas蛋白(CRISPR/CAS效应蛋白)、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述V型或VI型Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列；检测由V型或VI型Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸；所述单链核酸检测器选自单链DNA、单链RNA或单链DNA-RNA杂交体的任意一种或任意几种组合，所述单链核酸检测器不与所述gRNA杂交；/n所述V型Cas蛋白选自Cas12、Cas14家族蛋白的任意一种或任意几种组合；优选的，所述Cas12家族蛋白选自Cas12i、Cas12j、Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h中的一种或任意几种组合；更优选的，所述Cas12家族蛋白为Cas12i、Cas12j、Cas12a、Cas12b中的一种或任意几种组合物；所述VI型Cas蛋白选自Cas13家族蛋白，优选的，所述Cas13家族蛋白包括Cas13a、Cas13b。/n

【技术特征摘要】
20200529 CN 20201047812991.一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与V型或VI型Cas蛋白(CRISPR/CAS效应蛋白)、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述V型或VI型Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列；检测由V型或VI型Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸；所述单链核酸检测器选自单链DNA、单链RNA或单链DNA-RNA杂交体的任意一种或任意几种组合，所述单链核酸检测器不与所述gRNA杂交；
所述V型Cas蛋白选自Cas12、Cas14家族蛋白的任意一种或任意几种组合；优选的，所述Cas12家族蛋白选自Cas12i、Cas12j、Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h中的一种或任意几种组合；更优选的，所述Cas12家族蛋白为Cas12i、Cas12j、Cas12a、Cas12b中的一种或任意几种组合物；所述VI型Cas蛋白选自Cas13家族蛋白，优选的，所述Cas13家族蛋白包括Cas13a、Cas13b。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Cas蛋白为Cas12i和/或Cas12j。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述可检测信号通过以下方式进行检测：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。


4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述靶核酸包括核糖核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁亚峰，孙洁，刘锐恒，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37