基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法和应用，包括以下步骤：S1.制备超顺磁性四氧化三铁纳米粒子；S2.培养巨噬细胞；S3.巨噬细胞与超顺磁性四氧化三铁纳米粒子共孵育；S4.巨噬细胞继续培养；S5.收集仿生磁性囊泡。本发明专利技术将超顺磁性四氧化三铁纳米粒子与巨噬细胞孵育后，通过巨噬细胞经过类似外泌体释放的途径，产生仿生磁性囊泡，囊泡外部展现出磷脂膜的性能，同时具有良好磁响应性能，具有运用到生物医学领域的潜力。

【技术实现步骤摘要】
基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法和应用
本专利技术属于生物医学材料
，具体涉及一种基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法和应用。
技术介绍
近年来，磁性纳米粒子因其在技术和生物医学上的广泛应用而引起了人们的广泛关注。磁性纳米粒子在疾病诊断、免疫分析、磁共振成像(MRI)、生物分离和生物催化等生物医学领域具有广阔的应用前景。然而，一方面，当纳米进入生理环境时,它会迅速吸附蛋白质等生物大分子形成蛋白质晕，从而改变了纳米粒子的尺寸以及表面性质；另一方面，纳米粒子也会非特异性吸附生理环境中的细胞(如血细胞)，使其具有不同于原有材料的生物学特性，造成原有设计的功能受到影响。因此，各种抗非特异性吸附的物质被修饰在纳米粒子表面，例如聚乙二醇，牛血清白蛋白，两性离子，各类细胞膜(血小板膜，白细胞膜，肿瘤细胞膜等)。其中，细胞膜材料因其具有磷脂及细胞膜蛋白组分，一方面可以利用细胞膜特性降低非特异性吸附；另一方面，细胞膜蛋白的存在，可影响材料—细胞间的相互作用，实现对一些目标细胞的特异性靶向。当前，各类细胞膜修饰的仿生超顺磁性四氧化三铁纳米粒子(＞10nm)已被制备出并在生物医学材料领域得到运用，这些方法通常是将细胞膜组分通过物理破坏，机械挤压等一系列操作使其与磁性纳米粒子结合。这样的结合方式必然使细胞膜的结构被破坏，同时镶嵌在细胞膜上的蛋白也会存在丢失，进而影响生理学特性。因此，将细胞膜简单地、较为完整地引入拥有快速磁响应性能的仿生磁性纳米粒子上显得十分重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：针对上述现有技术中存在的不足，提供一种基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法和应用。本专利技术采用的技术方案如下：一种基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法，包括以下步骤：S1.制备超顺磁性四氧化三铁纳米粒子；S2.培养巨噬细胞；S3.移除S2培养的巨噬细胞中的原培养液，用磷酸盐缓冲液清洗3-5次，然后加入含有S1所得超顺磁性四氧化三铁纳米粒子和柠檬酸钠的无血清DMEM培养基，孵育2-3h，去除原培养基，用无血清DMEM培养基清洗3-5次；S4.向S3所得巨噬细胞中加入无血清DMEM培养基继续培养40-55h；S5.取S4培养容器中的上清液，用无血清DMEM培养基清洗2-3次后离心，弃去沉淀并保留上清液，然后进行磁分离，收集磁分离产物，用磷酸盐缓冲液清洗3-5次，即得。细胞可以释放出直径在100-1000nm的细胞外囊泡。这些细胞外囊泡含有磷脂双分子层以及蛋白和基因物质，在细胞间相互交流中具有十分重要的地位。巨噬细胞能够有效摄取纳米粒子，并且在一定条件下释放出负载纳米材料的细胞外囊泡，其细胞膜结构相对完整，功能性良好。本专利技术以合成超顺磁性四氧化三铁纳米粒子为原料，通过培养巨噬细胞，与四氧化三铁纳米粒子共孵育，随后在无血清条件下培养，细胞在这期间逐步释放出磁性囊泡，最后采用磁分离回收获取。本专利技术的巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法，超顺磁性四氧化三铁纳米粒子与巨噬细胞孵育后，可通过巨噬细胞经过类似外泌体释放的途径，产生仿生磁性囊泡，囊泡外部展现出磷脂膜的性能，同时具有良好磁响应性能。进一步地，S1具体制备方式为：将六水三氯化铁溶解在乙二醇中，边搅拌边加入柠檬酸钠，最后加入醋酸铵，室温下磁搅拌1-3h后置于180-250℃条件下保温15-20h，冷却，再采用磁分离法收集沉积物，并用乙醇和去离子水清洗3-5次，最后再次磁分离，即得。进一步地，S1具体制备方式为：将六水三氯化铁溶解在乙二醇中，边搅拌边加入柠檬酸钠，最后加入醋酸铵，室温下磁搅拌1h后置于200℃条件下保温16h，冷却，再采用磁分离法收集沉积物，并用乙醇和去离子水清洗4次，最后再次磁分离，即得。进一步地，六水三氯化铁、柠檬酸钠和醋酸铵的质量比为2-3:1:8-9。进一步地，六水三氯化铁、柠檬酸钠和醋酸铵的质量比为2.89:1:8.26。进一步地，S2具体培养方式为：采用含有10wt％胎牛血清和1wt％链霉素-青霉素的DMEM培养基培养巨噬细胞，培养过程中将细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中，培养40-55h。进一步地，S2中巨噬细胞为小鼠巨噬细胞J774A.1、P338D1、S774A.1或RAW264.7，也可采用其他巨噬细胞。进一步地，S3中超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的浓度为0.2-0.3mg/mL,柠檬酸钠的浓度为1.2-1.35mg/mL。进一步地，超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的浓度为0.28mg/mL，柠檬酸钠的浓度为1.29mg/mL。进一步地，S5中离心条件为800-3000rpm离心3-15min。进一步地，S3-S5的培养过程中，培养条件均为37℃、5％CO2。采用上述的方法得到的仿生磁性囊泡。上述的仿生磁性囊泡在制备医用材料方面的应用。综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术利用水热法合成超顺磁四氧化三铁纳米粒子，具有良好的磁响应行为，粒径分布较为均一，水相中分散性良好；2、本专利技术通过将超顺磁性四氧化三铁纳米粒子与巨噬细胞共孵育，通过巨噬细胞经过类似外泌体释放的途径，产生仿生磁性囊泡；3、本专利技术由巨噬细胞通过类似细胞外泌体形成途径进行构建，在更换培养基后静置即可让细胞自主释放磁性囊泡，无需其他人工操作；4、本专利技术方法得到的仿生磁性囊泡，最终通过磁分离收集，所需条件简单，回收效率高，操作便捷；5、本专利技术方法得到的仿生磁性囊泡，表面具有生物膜(如细胞膜)的一些基本性质，具有良好的磁响应性能，还具有潜在良好的生物抗污性能，能够被应用到生物医学领域。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为巨噬细胞释放仿生磁性囊泡示意图；图2为超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的粒径分布图；图3为超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的磁滞回线图；图4为仿生磁性囊泡的扫描电镜图；图5为超顺磁性四氧化三铁纳米粒子和仿生磁性囊泡的粒径大小图；图6为超顺磁性四氧化三铁纳米粒子和仿生磁性囊泡表面电位图；图7为仿生磁性囊泡的透射电镜图及其元素扫描；图8为PKH26对超顺磁性四氧化三铁纳米粒子和仿生磁性囊泡的染色成像图；图9为J774A.1细胞样品(J774A.1)，J774A.1细胞膜样品(M)以及仿生磁性囊泡(Fe3O4MVs)的SDS-PAGE图；图10为仿生磁性囊泡的磁响应性及回收效率图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1.制备超顺磁性四氧化三铁纳米粒子；/nS2.培养巨噬细胞；/nS3.移除S2培养的巨噬细胞中的原培养液，用磷酸盐缓冲液清洗3-5次，然后加入含有S1所得超顺磁性四氧化三铁纳米粒子和柠檬酸钠的无血清DMEM培养基，孵育2-3h，去除原培养基，用无血清DMEM培养基清洗3-5次；/nS4.向S3所得巨噬细胞中加入无血清DMEM培养基继续培养40-55h；/nS5.取S4培养容器中的上清液，用无血清DMEM培养基清洗2-3次后离心，弃去沉淀并保留上清液，然后进行磁分离，收集磁分离产物，用磷酸盐缓冲液清洗3-5次，即得。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.制备超顺磁性四氧化三铁纳米粒子；
S2.培养巨噬细胞；
S3.移除S2培养的巨噬细胞中的原培养液，用磷酸盐缓冲液清洗3-5次，然后加入含有S1所得超顺磁性四氧化三铁纳米粒子和柠檬酸钠的无血清DMEM培养基，孵育2-3h，去除原培养基，用无血清DMEM培养基清洗3-5次；
S4.向S3所得巨噬细胞中加入无血清DMEM培养基继续培养40-55h；
S5.取S4培养容器中的上清液，用无血清DMEM培养基清洗2-3次后离心，弃去沉淀并保留上清液，然后进行磁分离，收集磁分离产物，用磷酸盐缓冲液清洗3-5次，即得。


2.根据权利要求1所述的基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法，其特征在于，所述S1具体制备方式为：将六水三氯化铁溶解在乙二醇中，边搅拌边加入柠檬酸钠，最后加入醋酸铵，室温下磁搅拌1-3h后置于180-250℃条件下保温15-20h，冷却，再采用磁分离法收集沉积物，并用乙醇和去离子水清洗3-5次，最后再次磁分离，即得。


3.根据权利要求2所述的基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法，其特征在于，所述六水三氯化铁、柠檬酸钠和醋酸铵的质量比为2-3:1:8-9。

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【专利技术属性】
技术研发人员：吴尧，康珂，张宇佳，朱南行，李国浩，易强英，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51