一种抗肿瘤巨噬细胞的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种抗肿瘤巨噬细胞的制备方法，包括以下步骤：获得原代骨髓干细胞或分离外周血中单核细胞进行原代细胞培养，加入集落刺激因子7天后获得巨噬细胞；获得离体肿瘤细胞进行原代肿瘤细胞培养，并获得原代肿瘤细胞；将得到的原代肿瘤细胞及培养液进行放疗照射，收集放疗后的上清液，获得所需微颗粒和凋亡的肿瘤细胞碎片混合物；将得到的混合物进行离心，即得到所述携带肿瘤抗原微颗粒；将得到的微颗粒处理步骤1获得的原代巨噬细胞，即得到所述抗肿瘤巨噬细胞。该抗肿瘤巨噬细胞的制备方法，实现个性化治疗，制备出可针对患者不同的肿瘤抗原的巨噬细胞；制备工艺简单，较易生产。

【技术实现步骤摘要】
一种抗肿瘤巨噬细胞的制备方法
本专利技术涉及抗肿瘤领域，更特别地，涉及一种抗肿瘤巨噬方法的制备方法。
技术介绍
巨噬细胞是免疫反应中的下游效应关键的执行者，肿瘤微环境中，巨噬占50％以上，更重要的是巨噬细胞的比例与肿瘤的预后呈负相关，进一步说明了巨噬细胞在肿瘤中的重要性。肿瘤组织浸润区的巨噬细胞(TumorAssociatedMacrophages，TAMs)促进了肿瘤的进展，肿瘤细胞通过高表达CD47和巨噬细胞表面的SIRPα结合，直接导致肿瘤细胞不仅可以和肿瘤细胞和谐共处，而且还会通过促进肿瘤内血管的增殖，抑制效应T细胞等促进肿瘤的扩增和生长。以往针对巨噬细胞的应用集中在抑制单核细胞在肿瘤微环境分化为肿瘤相关巨噬细胞、杀伤肿瘤相关巨噬细胞以及促进微环境中TAMs重编程为M1等，但清除巨噬细胞会抑制全身免疫反应，使机体易感染。由此我们提出回输特异性抗肿瘤巨噬细胞从而发挥抑制肿瘤生长的效果。微颗粒由肿瘤细胞所释放，经放疗、双氧水或过氧化氢处理的肿瘤细胞释放更多携带肿瘤抗原的微颗粒，此种微颗粒可以促进巨噬细胞向M1极化，增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，也可协同效应T细胞发挥抗肿瘤效果。
技术实现思路
为解决以上问题，本专利技术提供了一种抗肿瘤巨噬细胞的制备方法，该抗肿瘤巨噬细胞通过直接吞噬肿瘤和激活T细胞发挥抗肿瘤效应，解决常规化疗效果差、副作用大、易产生耐药性的技术问题并实现个体化治疗。本专利技术是由以下技术手段实现的：一种抗肿瘤巨噬细胞的制备方法，包括以下步骤：步骤1、获得原代骨髓干细胞或分离外周血中单核细胞进行原代细胞培养，加入集落刺激因子7天后获得巨噬细胞；步骤2、获得离体肿瘤细胞进行原代肿瘤细胞培养，并获得原代肿瘤细胞；步骤3、将所述步骤2得到的原代肿瘤细胞及培养液进行放疗照射，收集放疗后的上清液，获得所需微颗粒和凋亡的肿瘤细胞碎片混合物；步骤4、将所述步骤3得到的混合物进行离心，即得到所述携带肿瘤抗原微颗粒；步骤5、将所述步骤4得到的微颗粒处理步骤1获得的原代巨噬细胞，即得到所述抗肿瘤巨噬细胞。所述的巨噬细胞可来源于人体外周血分离所得淋巴细胞所述携带肿瘤抗原的微颗粒来源于自体来源的肿瘤细胞或肿瘤细胞系产生的肿瘤细胞。所述离体肿瘤细胞来自于实体瘤。一种抗肿瘤巨噬细胞的制备方法制得的抗肿瘤巨噬细胞，所述抗肿瘤巨噬细胞为M1促炎巨噬细胞；所述抗肿瘤巨噬细胞表面CD86和MHCⅡ高表达，胞内CD206低表达；所诉抗肿瘤巨噬细胞具有更强吞噬肿瘤细胞的能力。一种抗肿瘤巨噬细胞的制备方法制得的抗肿瘤微巨噬细胞在抗肿瘤疗法中的应用。本专利技术具有以下优点：①实现个性化治疗，制备出可针对患者不同的肿瘤抗原的巨噬细胞；②制备工艺简单，较易生产；③生产所需周期短；④所需制备成本低；⑤功能可扩展：可对巨噬细胞进行基因编程，使其具有更强的激活免疫的作用。附图说明图1为本专利技术体外培养的巨噬细胞40倍显微镜下图；图2为本专利技术体外培养的巨噬细胞在微颗粒处理后的40倍镜下图；图3为本专利技术放疗来源微颗粒的电镜图；图4为本专利技术携带抗原微颗粒处理巨噬细胞后表面分子变化分析图；图5为本专利技术抗肿瘤巨噬细胞具有更强的吞噬肿瘤细胞能力的流式结果图；图6为本专利技术巨噬细胞腹腔注射治疗实体瘤过程中瘤体的体积统计图；具体实施方式以下结合实例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。本专利技术涉及一种抗肿瘤巨噬细胞的回输方法，其主要包括一种自体来源的巨噬细胞经过体外处理改造为抗肿瘤巨噬细胞。所诉抗肿瘤巨噬细胞由抗肿瘤微颗粒处理自体来源巨噬细胞获得。所述抗肿瘤巨噬细胞，具有较特异的抗肿瘤活性，具有更强的吞噬肿瘤细胞的能力。可抑制实体瘤的生长。所述巨噬细胞来自患者本身，微颗粒来源于肿瘤细胞自体，生物安全性和生物相容性好。所诉抗肿瘤巨噬细胞也可经过改造，具有更强迁移能力，也可联合免疫调节药物进行治疗。本专利技术的具体原理如下：Nature曾报导将巨噬细胞回输后巨噬细胞定植在小鼠体内可持续一年并保持活性，而促炎型巨噬细胞在抗肿瘤免疫中发挥了重要作用。也有文献将M-CSF和IFN-γ转染进巨噬细胞瘤内注射可以获得良好的抗肿瘤效果。促炎型巨噬细胞可发挥抗肿瘤效果，同时巨噬细胞也有抗原递呈的作用，而微颗粒携带肿瘤细胞抗原，微颗粒处理巨噬细胞既可促进巨噬细胞极化为抗炎型巨噬细胞也可让巨噬细胞处理肿瘤细胞的抗原进一步激活T细胞从而发挥抗肿瘤效果。一种抗肿瘤巨噬细胞的制备方法，包括以下步骤：步骤1、获得原代骨髓干细胞或分离外周血中单核细胞进行原代细胞培养，加入集落刺激因子7天后获得巨噬细胞；步骤2、获得离体肿瘤细胞进行原代肿瘤细胞培养，并获得原代肿瘤细胞；步骤3、将所述步骤2得到的原代肿瘤细胞及培养液进行放疗照射，收集放疗后的上清液，获得所需微颗粒和凋亡的肿瘤细胞碎片混合物；步骤4、将所述步骤3得到的混合物进行离心，即得到所述携带肿瘤抗原微颗粒；步骤5、将所述步骤4得到的微颗粒处理步骤1获得的原代巨噬细胞，即得到所述抗肿瘤巨噬细胞。所述的巨噬细胞可来源于人体外周血分离所得淋巴细胞所述携带肿瘤抗原的微颗粒来源于自体来源的肿瘤细胞或肿瘤细胞系产生的肿瘤细胞。所述离体肿瘤细胞来自于实体瘤。一种抗肿瘤巨噬细胞的制备方法制得的抗肿瘤巨噬细胞，所述抗肿瘤巨噬细胞为M1促炎巨噬细胞；所述抗肿瘤巨噬细胞表面CD86和MHCⅡ高表达，胞内CD206低表达；所诉抗肿瘤巨噬细胞具有更强吞噬肿瘤细胞的能力。一种抗肿瘤巨噬细胞的制备方法制得的抗肿瘤微巨噬细胞在抗肿瘤疗法中的应用。所诉抗肿瘤巨噬细胞可腹腔和尾静脉注射。本专利技术所述抗肿瘤巨噬细胞的光镜图如图1所示。下文结合实施例对本专利技术的效果作进一步解释和验证。1.骨髓来源巨噬细胞的培养C57BL/6小鼠断颈处死后置于75％酒精中浸泡20min，取出小鼠放入超净工作台中。用眼科剪、眼科镊按顺序剥离小鼠的股骨及胫骨处皮肤与肌肉，剪断股骨/胫骨两端，用1ml无菌注射器吸取培养基由断端冲出骨髓，至肉眼可见骨质变白。收集含有骨髓的培养基，离心后弃去上清，加入含20ng/mlM-CSF的完全培养基，调整细胞浓度1*106ml于六孔板中，于铺板后第一、第四天更换新鲜含有20ng/mlM-CSF的完全培养基1ml/孔，第7天时即可分化成熟为巨噬细胞，认为此时巨噬细胞状态为M0，接下来可继续进行后续实验。若想得到M1/M2，则加入对应种属100ng/mlLPS+20ng/mlIFN-γ或20ng/mlIL-4+20ng/mlIL-1324h可诱导M0分化为M1或M2。微颗粒诱导前后巨噬细胞光镜下图如图1和图2所示。2.微颗粒的提取在10mm×10mm的培养皿中用10％FBS(胎本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗肿瘤巨噬细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1、获得原代骨髓干细胞或分离外周血中单核细胞进行原代细胞培养，加入集落刺激因子7天后获得巨噬细胞；/n步骤2、获得离体肿瘤细胞进行原代肿瘤细胞培养，并获得原代肿瘤细胞；/n步骤3、将所述步骤2得到的原代肿瘤细胞及培养液进行放疗照射，收集放疗后的上清液，获得所需微颗粒和凋亡的肿瘤细胞碎片混合物；/n步骤4、将所述步骤3得到的混合物进行离心，即得到所述携带肿瘤抗原微颗粒；/n步骤5、将所述步骤4得到的微颗粒处理步骤1获得的原代巨噬细胞，即得到所述抗肿瘤巨噬细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗肿瘤巨噬细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、获得原代骨髓干细胞或分离外周血中单核细胞进行原代细胞培养，加入集落刺激因子7天后获得巨噬细胞；
步骤2、获得离体肿瘤细胞进行原代肿瘤细胞培养，并获得原代肿瘤细胞；
步骤3、将所述步骤2得到的原代肿瘤细胞及培养液进行放疗照射，收集放疗后的上清液，获得所需微颗粒和凋亡的肿瘤细胞碎片混合物；
步骤4、将所述步骤3得到的混合物进行离心，即得到所述携带肿瘤抗原微颗粒；
步骤5、将所述步骤4得到的微颗粒处理步骤1获得的原代巨噬细胞，即得到所述抗肿瘤巨噬细胞。


2.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤巨噬细胞的制备方法，其特征在于，步骤1中所述培养为含10ng/mlM-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、FBS(胎牛血清),并于第3天和第5天换液，第7天所得为巨噬细胞；0.04mg/ml步骤4)所得微颗粒处理50万巨噬细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑俊武，金红林，万超，黄浩，郑成武，卫路，洪磊，金秀妍，刘群，
申请(专利权)人：武汉圣润生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42