一种经基因工程改造的抗肿瘤微颗粒的制备方法及应用技术

本发明专利技术提供一种经基因工程改造的抗肿瘤微颗粒的制备方法，包括以下步骤：S1、构建过表达GM‑CSF和跨膜过表达GM‑CSF的重组质粒；S2、获得离体肿瘤细胞进行原代肿瘤细胞培养，并获得原代肿瘤细胞；S3、包装过表达GM‑CSF和跨膜过表达GM‑CSF的慢病毒颗粒；S4、用慢病毒颗粒对所述步骤S2得到的原代肿瘤细胞进行感染，得到过表达GM‑CSF和跨膜过表达GM‑CSF的原代肿瘤细胞；S5、将所述步骤S4得到的原代肿瘤细胞及培养液进行X线照射，收集放疗后的上清液，获得所需微颗粒和凋亡的肿瘤细胞碎片混合物；S6、将所述步骤S5得到的混合物进行离心，本发明专利技术可解决常规局部化疗效果差、副作用大、易产生耐药性、对机体免疫产生抑制的技术问题。

【技术实现步骤摘要】
一种经基因工程改造的抗肿瘤微颗粒的制备方法及应用
本专利技术涉及抗肿瘤
，具体为一种经基因工程改造的抗肿瘤微颗粒的制备方法及应用。
技术介绍
放射治疗是临床常规治疗肿瘤的有效治疗手段，肿瘤放射治疗是利用放射线产生的电离辐射来治疗肿瘤的一种局部治疗方法。大约70％以上的肿瘤患者在治疗的过程中需要用放射治疗，约有40％的癌症可以用放疗根治。放射治疗在肿瘤治疗中的作用和地位日益突出，已成为治疗恶性肿瘤的主要手段之一，尤其在头颈肿瘤、乳腺癌、肺癌和宫颈癌等一些肿瘤治疗中发挥着重要作用。但临床上有些肿瘤并不常规接受放射治疗，如胃癌、结肠癌、膀胱癌、肾癌，以及恶性胸腔积液(Malignantpleuraleffusion,MPE)等。虽然采用粒子植入等肿瘤内照射方式可以扩大放疗的适应症，但对外科手术技能要求较高，且存在手术风险。另外，此种方式也无法针对MPE进行治疗。基因工程(geneticengineering)，又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入宿主细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新的表征。本技术的主要工具包括酶(限制性核酸内切酶和DNA连接酶)和载体(主要有质粒载体、噬菌体载体、Ti质粒和人工染色体等)，主要步骤为提取目的基因、目的基因与运载体结合、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和表达。目前，基因工程技术在各个领域具有广泛的应用，尤其是医药卫生领域。基因工程药品(如基因工程胰岛素、基因工程干扰素等)是指将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物后提取药物，在解决产量问题的同时可大大降低生产成本。基因治疗是把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。但基因治疗技术尚未成熟，一些关键问题尚未解决，如如何选择有效的治疗基因等。
技术实现思路
为解决以上问题，本专利技术提供了一种经基因工程改造的抗肿瘤微颗粒的制备方法、药剂及应用，该抗肿瘤微颗通过间接放疗并趋化免疫细胞至肿瘤微环境中以实现抗肿瘤，解决常规局部化疗效果差、副作用大、易产生耐药性、对机体免疫产生抑制的技术问题。本专利技术是由以下技术手段实现的：一种经基因工程改造的抗肿瘤微颗粒的制备方法，包括以下步骤：S1构建过表达GM-CSF和跨膜过表达GM-CSF的质粒；S2获得离体肿瘤细胞进行原代肿瘤细胞培养，并获得原代肿瘤细胞；S3包装过表达GM-CSF和跨膜过表达GM-CSF的慢病毒颗粒；S4用慢病毒颗粒对所述步骤S2得到的原代肿瘤细胞进行感染，得到过表达GM-CSF和跨膜过表达GM-CSF的原代肿瘤细胞；S5将所述步骤S4得到的原代肿瘤细胞及培养液进行X线照射，收集放疗后的上清液，获得所需微颗粒和凋亡的肿瘤细胞碎片混合物；S6将所述步骤S5得到的混合物进行离心，即得到所述基因工程改造的抗肿瘤微颗粒。步骤S6中所述离心包括依次进行第一离心、第二离心、第三次离心所述第一离心的转速为1000g，时间为10分钟，得上清；第二离心的转速为14000g，时间为2分钟，得上清；第三次离心的转速为14000g，时间为60分钟，得沉淀即为微颗粒。所述步骤S5的X线放射剂量为5-20Gy，X线能量为6MV，所述上清液收集时间为放疗后的第2-7天。所述肿瘤细胞系为小鼠肺癌细胞系Lewis细胞，所述离体肿瘤细胞来自于实体瘤。一种经基因工程改造的抗肿瘤微颗粒的制备方法制得的抗肿瘤微颗粒，所述经基因工程改造的抗肿瘤微颗粒为携载GM-CSF的微囊泡结构，所述微囊泡结构的粒径为100-1000nm。一种经基因工程改造的抗肿瘤微颗粒药剂，由所述的经基因工程改造的抗肿瘤微颗粒通过纯化和浓缩而获得。一种经基因工程改造的抗肿瘤微颗粒的制备方法制得的经基因工程改造的抗肿瘤微颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。有益效果本专利技术提供了一种经基因工程改造的抗肿瘤微颗粒的制备方法及应用。具备以下有益效果：①对不能进行放射治疗的肿瘤，可以采用本技术制得药剂实现间接放疗；②相较于放疗，本技术可通过静脉注射药剂，反复多次给药，可实现对转移瘤起到抑制作用；③可有效趋化免疫细胞到肿瘤微环境中，促进抗肿瘤免疫的作用；④自体来源的微颗粒制得的药剂具有较好的生物安全性和生物相容性；⑤制备工艺简单，便于规模化生产；⑥功能可扩展：自组装多肽材料可联合小分子靶向抑制剂，或直接再负载化疗药物直接杀伤肿瘤。附图说明图1为本专利技术放疗产生微颗粒、膜GM-CSF微颗粒和GM-CSF微颗粒的电镜图；图2为本专利技术放疗产生微颗粒、膜GM-CSF微颗粒和GM-CSF微颗粒的粒径图；图3为本专利技术所用质粒载体图谱；图4为本专利技术所设计的核心质粒1目的基因序列；图5为本专利技术所设计的核心质粒2目的基因序列；图6为稳转肿瘤细胞膜表面GM-CSF含量检测；图7为本专利技术放疗产生微颗粒、膜GM-CSF微颗粒和GM-CSF微颗粒整体GM-CSF含量检测；图8为本专利技术放疗产生微颗粒、膜GM-CSF微颗粒和GM-CSF微颗粒表面GM-CSF含量检测；图9为本专利技术放疗产生微颗粒、膜GM-CSF微颗粒和GM-CSF微颗粒的趋化作用小室图；图10为本专利技术放疗产生微颗粒、膜GM-CSF微颗粒和GM-CSF微颗粒的趋化作用统计图；图11为本专利技术放疗产生微颗粒、膜GM-CSF微颗粒和GM-CSF微颗粒治疗实体瘤过程中瘤体的体积统计图；图12为本专利技术放疗产生微颗粒、膜GM-CSF微颗粒和GM-CSF微颗粒治疗实体瘤过程中小鼠的体重统计图；图13为本专利技术膜GM-CSF微颗粒治疗恶性胸腔积液过程中小鼠的生存统计图。。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。本专利技术涉及一种基于基因工程改造的可替代放射治疗进行间接放疗的抗肿瘤技术，其主要包括一种自体来源的经基因工程改造的抗肿瘤微颗粒的研制，所述抗肿瘤微颗粒由基因工程改造的肿瘤细胞受放射线处理所产生。所述经基因工程改造的抗肿瘤微颗粒，具有显著的抗肿瘤活性，可趋化免疫细胞达到肿瘤微环境，能提高抗肿瘤免疫，对实体瘤起到控制作用。所述经基因工程改造的抗肿瘤微颗粒完全来自肿瘤细胞自体，生物安全性和生物相容性好。经基因工程改造的抗肿瘤微颗粒也可以负载化疗药物和靶向药物，或者联合小分子靶向药物直接作用于肿瘤。本专利技术的具体原理如下：微颗粒(microparticle)是一种能被多种活细胞分泌，直径为100～1000nm，并广泛分布于多种体液中的微囊泡结构。近10年来研究发现微颗粒因为其富含蛋白质、DNA、RNA和脂质等生物活性分子而参与细胞之间的信号交流，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种经基因工程改造的抗肿瘤微颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、构建过表达GM-CSF和跨膜过表达GM-CSF的质粒；/nS2、获得离体肿瘤细胞进行原代肿瘤细胞培养，并获得原代肿瘤细胞；/nS3、包装过表达GM-CSF和跨膜过表达GM-CSF的慢病毒颗粒；/nS4、用慢病毒颗粒对所述步骤S2得到的原代肿瘤细胞进行感染，得到过表达GM-CSF和跨膜过表达GM-CSF的原代肿瘤细胞；/nS5、将所述S4得到的原代肿瘤细胞及培养液进行X线照射，收集放疗后的上清液，获得所需微颗粒和凋亡的肿瘤细胞碎片混合物；/nS6、将所述S5得到的混合物进行离心，即得到所述基因工程改造的抗肿瘤微颗粒。/n

【技术特征摘要】
1.一种经基因工程改造的抗肿瘤微颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、构建过表达GM-CSF和跨膜过表达GM-CSF的质粒；
S2、获得离体肿瘤细胞进行原代肿瘤细胞培养，并获得原代肿瘤细胞；
S3、包装过表达GM-CSF和跨膜过表达GM-CSF的慢病毒颗粒；
S4、用慢病毒颗粒对所述步骤S2得到的原代肿瘤细胞进行感染，得到过表达GM-CSF和跨膜过表达GM-CSF的原代肿瘤细胞；
S5、将所述S4得到的原代肿瘤细胞及培养液进行X线照射，收集放疗后的上清液，获得所需微颗粒和凋亡的肿瘤细胞碎片混合物；
S6、将所述S5得到的混合物进行离心，即得到所述基因工程改造的抗肿瘤微颗粒。


2.根据权利要求1所述的一种经基因工程改造的抗肿瘤微颗粒的制备方法，其特征在于，S6中所述离心包括依次进行第一离心、第二离心、第三次离心，所述第一离心的转速为1000g，时间为10分钟，得上清；第二离心的转速为14000g，时间为2分钟，得上清；第三次离心的转速为14000g，时间为60分钟，得沉淀即为微颗粒。


3.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑俊武，金红林，万超，黄浩，郑成武，卫路，洪磊，金秀妍，刘群，
申请(专利权)人：武汉圣润生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42