家畜血浆、乳和尿中同时测定游离及结合型木脂素的方法技术

本发明专利技术公开一种液‑质联用法从奶羊/牛的乳汁和血液等组织提取液中同时定量多种哺乳动物木脂素。利用液‑质联用的多反应检测模式，根据肠内酯及肠二醇的硫酸化物产生[M‑H‑80]

【技术实现步骤摘要】
家畜血浆、乳和尿中同时测定游离及结合型木脂素的方法
本专利技术属于食品
，特别涉及以亚麻籽或亚麻籽粕饲喂奶牛或奶羊后，体内哺乳动物木脂素原型的高灵敏定量方法。测定的哺乳动物木脂素既包括以肠内酯和肠二醇为代表的游离型也包括其葡萄糖醛酸和硫酸结合物。本专利技术涉及该测定方法在家畜产品质量检测中的应用。
技术介绍
亚麻籽油是ω-3脂肪酸的重要来源，每年在全世界大量生产使用。亚麻籽及其榨油后残留的亚麻粕富含木脂素，可在肠道细菌的参与下进行生物转化，形成开环异落叶松树脂酚（SECO）、2-[（4-羟基-3-甲氧基苯基）甲基]-3-[（3-羟基苯基）甲基]-1,4-丁二醇（PPB）、肠二醇（ED），和肠内酯（EL）(Eeckhaut,E.,Struijs,K.,Possemiers,S.,Vincken,J.P.,DeKeukeleire,D.,Verstraete,W.2008.Metabolismofthelignanmacromoleculeintoenterolignansinthegastrointestinallumenasdeterminedinthesimulatorofthehumanintestinalmicrobialecosystem.J.Agric.Food.Chem.56:4806−4812)。在哺乳动物尿液和血浆中，木脂素常以结合形式存在，如ED的硫酸化物（ED-S）、EL的硫酸化物（EL-S）、ED的葡萄糖醛酸苷（ED-G）和EL的葡萄糖醛酸苷（EL-G）(Axelson,M.,Setchell,KDR.1980.Conjugationoflignansinhuman-urine.FEBSLett.122:49−53)。血浆哺乳动物木脂素水平升高与结直肠腺瘤风险降低相关(Kuijsten,A.,Arts,I.C.W.,Hollman,P.C.H.,van’tVeer,P.,Kampman,E.2006.Plasmaenterolignansareassociatedwithlowercolorectaladenomarisk.CancerEpidemiol.BiomarkersPrev.15:1132–1136),也与心血管疾病的发生呈负相关(Vanharanta,M.,Voutilainen,S.,Lakka,T.A.,vanderLee,M.,Adlercreutz,H.,Salonen,J.T.1999.Riskofacutecoronaryeventsaccordingtoserumconcentrationsofenterolactone:Aprospectivepopulation-basedcase-controlstudy.Lancet354:2112–2115)。当饲喂富含EL的牛奶时，牛犊可很好吸收哺乳动物木脂素，提示人类食用富含EL的牛奶也可能获得健康益处(Ghedini,C.P.,Whitehouse,N.L.,Moura,D.C.,Oliveira,A.S.,Brito,A.F.2017.Themammalianlignanenterolactoneisabsorbedbynewborndairycalvesfedenterolactone-enrichedmilk.J.DairySci.100:8170–8175)。因此，定量测定家畜奶液和血浆中的哺乳动物木脂素对于监控畜产品质量具有重要意义。高效液相色谱和气相色谱法已用于定性和定量分析哺乳动物血液、尿液等中的ED和EL(Adlercreutz,H.,Fotsis,T.,Lampe,J.,Wahala,K.,Makela,T.,Brunow,G.,Hase,T.1993.Quantitative-determinationoflignansandisoflavonoidsinplasmaofomnivorousandvegetarianwomenbyisotope-dilutiongas-chromatographymass-spectrometry.Scand.J.Clin.Lab.Invest.53:5−18;Norskov,N.P.,Olsen,A.,Tjonneland,A.,Bolvig,A.K.,Laerke,H.N.,Knudsen,K.E.B.2015.TargetedLC-MS/MSmethodforthequantitationofplantlignansandenterolignansinbiofluidsfromhumansandpigs.J.Agric.FoodChem.63:6283−6292)。通常先用酶将葡萄糖醛酸和硫酸结合物水解，分析测定游离的哺乳动物木脂素。对木脂素结合物的直接定量可以反映哺乳动物木脂素在血浆中的实际状态。另外，绵羊生成葡萄糖醛酸和硫酸结合物的能力大于牛的能力(Brito,A.F.,Zang,Y.2019.AReviewofLignanmetabolism,milkenterolactoneconcentration,andantioxidantstatusofdairycowsfedflaxseed.Molecules24:41)。因此，开发可直接定量奶羊体内哺乳动物木脂素葡萄糖醛酸和硫酸结合物的测定方法十分重要。本专利技术涉及饲喂亚麻籽粕的绵羊尿液中游离型和结合型木脂素的分离纯化和鉴定，及以这些木脂素为标准品，建立羊奶和血浆中多种木脂素的定量分析方法。本专利技术公开了样品预处理手段和定量参数，特别是游离及结合型哺乳动物木脂素在质谱中的母离子和特征子离子，及在此基础上同时灵敏定量游离和结合型木脂素的液-质联用方法。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是提供一种定量分析多种哺乳动物木脂素的液-质联用方法，该方法基于木脂素的特征母离子和子离子采用多反应监测模式。本专利技术还涉及所建立木脂素定量方法在家畜血浆、乳液及尿等组织提取液或相关食品、药品、化妆品等质量控制中的应用。本专利技术采用如下方案解决上述技术问题：从饲喂亚麻籽或亚麻籽粕的奶牛或奶羊尿液中分离纯化SECO、PPB、ED、EL、ED-S、EL-S；结合质谱和核磁共振波谱鉴定了这些木脂素的结构；以纯化的木脂素为标准品，优化其在奶牛尿、乳和血浆中的定量参数；本专利技术提供上述哺乳动物木脂素在质谱检测中的母离子和特征性子离子：为了提高检测灵敏度，本专利技术还提供奶和血浆的预处理方法；本专利技术的另一个方面，提供同时检测上述哺乳动物木脂素的液-质联用方法；本专利技术还提供检测多种哺乳动物木脂素的液-质联用方法在乳制品和肉制品等中的应用；在本专利技术利用液-质联用方法检测畜产品哺乳动物木脂素的一个优选方案中有以下步骤：1）血浆和奶用含1%甲酸的乙腈预处理，并通过HybridSPE-PL55261-U小柱；2）用液-质联用，优选三重四极杆质谱，C18分析柱，0.1%甲酸水-甲醇梯度洗脱，优化洗脱程序；3）使用第2步优化的洗脱程序进行色谱分离，联用负电离的多反应监测模式质谱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种液-质联用定量测定牲畜血浆、乳汁及其产品中哺乳动物木脂素的方法，其特征在于：直接测定多种游离型和结合型哺乳动物木脂素在动物体内的原型。/n

【技术特征摘要】
1.一种液-质联用定量测定牲畜血浆、乳汁及其产品中哺乳动物木脂素的方法，其特征在于：直接测定多种游离型和结合型哺乳动物木脂素在动物体内的原型。


2.一种液-质联用定量测定牲畜血浆、乳汁及其产品中哺乳动物木脂素的方法，步骤特征是：
（1）样品溶液制备：血浆和奶用含1%甲酸的乙腈预处理，并通过HybridSPE-PL55261-U小柱；
（2）液-质联用分析：利用三重四极杆质谱，C18分析柱，0.1%甲酸水-甲醇梯度洗脱进行色谱分离，联用负电离...

【专利技术属性】
技术研发人员：马超美，庄聪聪，郑重，冯旭，许海燕，张立，刘岭，张功，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15