一种马尾松miRNA前体基因的克隆方法技术

本发明专利技术公开了一种马尾松miRNA前体基因的克隆方法，属于植物分子生物学领域。本发明专利技术提供的马尾松miRNA前体基因的克隆方法，分别对miRNA前体基因的PCR扩增体系和PCR反应条件进行优化，退火温度控制在64‑68℃，循环次数为34‑35次，以及改变琼脂糖凝胶电泳的胶浓度、电压和电泳时间，实现成功高效地克隆马尾松miR172和miR947前体基因。本发明专利技术方法特异性强，目的基因的产量高，在前体基因的关键成熟序列区域无碱基错配现象，获得的前体基因序列与目的基因序列同源性高达100％。有利于进一步构建植物表达载体，用于转基因植物的培育，在农林作物遗传改良和分子育种方面具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种马尾松miRNA前体基因的克隆方法
本专利技术属于植物分子生物学领域，更具体地说，涉及一种马尾松miRNA前体基因的克隆方法。
技术介绍
马尾松(PinusmassonianaLamb.)为中国南方特有树种，具有分布广、适应性强、生长快、用途大等特点，在林业生产中占有重要地位，是当今建材工业、造纸工业、化纤工业、松香和松节油化学工业等主要原料。马尾松的扩大繁殖方式主要是通过有性繁殖进行，而人们大规模获取遗传改良的种子，主要是依靠马尾松种子园建设来实现的。但自1980年以来建立的众多马尾松无性系种子园，都面临着童期长，雌球花、雄球花的着生量不均衡以及花期同步性不长等问题，难以为大面积造林提供足够的优质种子。研究马尾松开花规律是良种生产研究的重要内容之一，提高花粉和种子产量，可望创造更大的经济利益。miRNA(microRNA)是一组由基因组编码的长度约20～23个核苷酸的非编码RNA，在物种进化中相当保守，在植物、动物和真菌中发现的miRNA大部分在特定的组织和发育阶段表达。miRNA的组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种马尾松miRNA前体基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)以马尾松基因组DNA或cDNA为模板，PCR扩增获得miRNA前体基因；/n2)琼脂糖凝胶电泳纯化和回收步骤1)获得的miRNA前体基因；/n3)将步骤2)获得的miRNA前体基因与克隆载体连接，然后转化、筛选大肠杆菌，获得阳性菌株；/n4)摇菌培养步骤3)获得的阳性菌株，回收含miRNA前体基因的载体，进行PCR检测和测序分析。/n

【技术特征摘要】
1.一种马尾松miRNA前体基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以马尾松基因组DNA或cDNA为模板，PCR扩增获得miRNA前体基因；
2)琼脂糖凝胶电泳纯化和回收步骤1)获得的miRNA前体基因；
3)将步骤2)获得的miRNA前体基因与克隆载体连接，然后转化、筛选大肠杆菌，获得阳性菌株；
4)摇菌培养步骤3)获得的阳性菌株，回收含miRNA前体基因的载体，进行PCR检测和测序分析。


2.根据权利要求1所述的马尾松miRNA前体基因的克隆方法，其特征在于，步骤1)中所述的PCR，其反应条件为：94℃3min；94℃30sec，55-68℃30sec，72℃1min，30-35个循环；72℃7min。


3.根据权利要求2所述的马尾松miRNA前体基因的克隆方法，其特征在于，步骤1)中所述的PCR，其反应条件为：94℃3min；94℃30sec，64-68℃30sec，72℃1min，34-35个循环；72℃7min。


4.根据权利要求1所述的马尾松miRNA前体基因的克...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐立安，叶友菊，胥猛，倪州献，韩炘，辛月，田雅婷，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32