一种用于核酸扩增的冻干粉试剂及其制备方法和使用方法技术

本本申请属于核酸纯化技术领域，具体为一种用于核酸扩增的冻干粉试剂及其制备方法和使用方法，包括下述原料：荧光PCR扩增缓冲液、引物、探针、热启动Taq酶、UNG酶、dNTP9和冻干保护剂。本申请适用于任何一种荧光PCR扩增试剂的预处理；且本申请减少操作步骤、提高试剂稳定性，保证临床荧光PCR检测结果的可靠性，实现常温保存及运输，减少企业生产成本及客户使用成本。

【技术实现步骤摘要】
一种用于核酸扩增的冻干粉试剂及其制备方法和使用方法
本申请属于核酸纯化
，具体为一种用于核酸扩增的冻干粉试剂及其制备方法和使用方法。
技术介绍
核酸扩增技术是分子生物学领域常用的技术，聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)是使用最为广泛的核酸扩增技术，可以扩增和分离目的基因，以其灵敏性、特异性和快速性得到广泛应用。然而，PCR技术需要反复的热变性，无法摆脱依赖精良仪器设备的局限，从而限制了其在临床现场检测中的应用。自20世纪90年代初，很多实验室尝试发展无须热变性的核酸恒温扩增技术，现已开发出了如依赖核酸序列的扩增、链置换扩增、核酸序列扩增、转录酶扩增、滚环扩增、环介导恒温扩增、解链酶扩增等多种恒温扩增技术。一般的核酸检测过程主要包括核酸提取、核酸扩增以及产物分析三个部分。在实验室研究中，核酸提取试剂和核酸扩增试剂各组分往往独立保存，使用前按照相应的需求配置混合即可，核酸扩增反应的必要条件包括：反应缓冲系统、引物、探针、各种酶类、dNTP等等。引物、探针、dNTP是一些通过化学方法合成的试剂，常温保存会破坏起基本结构从而影响后续的使用效果，一般是在-20℃下保存；核酸扩增反应还需要各种各样的酶来促进反应的特异性发生，而酶类作为一种活性蛋白，必须低温保存才能有活性，保存不善，将会直接影响扩增准确性，酶在干燥的情况比潮湿情况下对温度的耐受力要高，所以制成干粉的酶制剂更易于保存。核酸检测试剂应用场景较多，普遍需要进行低温运输与低温保存，运输保存成本高，多场景应用难度大。反应缓冲液一般无需低温保存，引物、探针、dNTP需要低温保存，酶类需要单独低温保存，而且使用需要反复冻融和配制，极其不方便，也易造成交叉污染。这些极大地增加了核酸检测应用成本和操作成本。因此，为了满足临床需求，亟需专利技术一种使用方便、且不需要低温运输及保存的荧光PCR扩增试剂。
技术实现思路
为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种用于核酸扩增的冻干粉试剂及其制备方法和使用方法，本申请是通过下述方案实现的：一种用于核酸扩增的冻干粉试剂，包括下述原料：荧光PCR扩增缓冲液、引物、探针、热启动Taq酶、UNG酶、dNTP9和冻干保护剂。优选的，包括下述体积份数的原料：4-6份荧光PCR扩增缓冲液、1-3份引物、0.2-1份探针、0.2-1份热启动Taq酶、0.1-0.3份UNG酶、2-10份dNTP9和35-38份冻干保护剂。优选的，包括下述体积份数的原料：5份荧光PCR扩增缓冲液、2份引物、0.5份探针、0.5份热启动Taq酶、0.2份UNG酶、5份dNTP9和36.8份冻干保护剂；所述印务包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的体积比为1:1。优选的，所述冻干保护剂包括下述原料：甘油，蔗糖，DTT，牛血清白蛋白，Proclin300，甲酰胺和ddH20。优选的，所述冻干保护剂包括下述体积份数的原料：0.5-2份甘油，5-8份蔗糖，0.05-0.2份DTT，1-3份牛血清白蛋白，0.3-0.9份Proclin300，0.1-0.3份甲酰胺和25-28份ddH20。优选的，所述冻干保护剂包括下述体积份数的原料：1份甘油，6.7份蔗糖，0.1份DTT，2份牛血清白蛋白，0.6份Proclin300，0.2份甲酰胺和26.2份ddH20。优选的，所述荧光PCR扩增缓冲液的浓度为10x，上游引物的浓度为50μmol/L，下游引物的浓度为50μmol/L，探针的浓度为50μmol/L，热启动Taq酶的浓度为5U/μL，UNG酶的浓度为1U/μL、dNTP9的浓度为100mmol/L。一种用于核酸扩增的试剂的冻干粉冻干方法，(1)将荧光PCR扩增缓冲液、引物、探针、热启动Taq酶、UNG酶、dNTP9和冻干保护剂于23℃下混合均匀，并平均分装到八联管中；(2)预冻：将八联管置于冻干机中，冻干机降温至-40℃，降温时间70min，后保温3h；(3)升华干燥：将冻干机内压力至升0.16mbar、温度至降-45℃，此过程用时40min；后将冻干机内温度由-45℃升至55℃并保温6h，此过程用时1h；(4)将冻干机内压力降至0.10mbar，此过程用时1h；(5)将冻干机内温度由55℃降升至30℃并保温6h，此过程用时1h；(6)取出八连管，封盖待用，常温避光保存。优选的，步骤如下：将冻干粉试剂、Tween20、蔗糖、Tris-HCl、NaCl和ddH20混合均匀得冻干粉溶解液，冻干粉溶解液即可直接使用。优选的，所述冻干粉溶解液中Tween20的浓度为0.5％，蔗糖的浓度为3％、Tris-HCl的浓度为10mmol/L、NaCl的浓度为20mmol/L。有益效果：本申请适用于任何一种荧光PCR扩增试剂的预处理；且本申请减少操作步骤、提高试剂稳定性，保证临床荧光PCR检测结果的可靠性，实现常温保存及运输，减少企业生产成本及客户使用成本。Proclin300与DTT共同作用，能够保证酶的稳定性，且不影响Taq酶的活性；甘油、牛血清白蛋白二者结合能够保证酶在冻干后高盐条件下的活性；蔗糖和甲酰胺共同作用，在保持酶活性的同时能够避免引物二聚体的产生；；Tween20和蔗糖协同，可使干粉完全溶解并且在溶解过程中保持酶的活性。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本申请冻干粉试剂结果图；图2为液体试剂结果图；图3为样本1第0天扩增曲线图；图4为样本1第7天扩增曲线图；图5为样本1第14天扩增曲线图；图6为样本2第0天扩增曲线图；图7为样本2第7天扩增曲线图；图8为样本2第14天扩增曲线图；图9为样本3第0天扩增曲线图；图10为样本3第7天扩增曲线图；图11为样本3第14天扩增曲线图；具体实施方式为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本申请实施方式作进一步地详细描述。实施例1一种用于核酸扩增的冻干粉试剂，包括下述原料：荧光PCR扩增缓冲液、引物、探针、热启动Taq酶、UNG酶、dNTP9和冻干保护剂。实施例2在实施例1的基础上包括下述体积份数的原料：：4-6份荧光PCR扩增缓冲液、1-3份引物、0.2-1份探针、0.2-1份热启动Taq酶、0.1-0.3份UNG酶、2-10份dNTP9和35-38份冻干保护剂。实施例3在实施例2的基础上，包括下述体积份数的原料：5份荧光PCR扩增缓冲液、2份引物、0.5份探针、0.5份热启动Taq酶、0.2份UNG酶、5份dNTP9和36.8份冻干保护剂；所述印务包括上游引本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于核酸扩增的冻干粉试剂，其特征在于，包括下述原料：荧光PCR扩增缓冲液、引物、探针、热启动Taq酶、UNG酶、dNTP9和冻干保护剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于核酸扩增的冻干粉试剂，其特征在于，包括下述原料：荧光PCR扩增缓冲液、引物、探针、热启动Taq酶、UNG酶、dNTP9和冻干保护剂。


2.如权利要求1所述的一种用于核酸扩增的冻干粉试剂，其特征在于，包括下述体积份数的原料：4-6份荧光PCR扩增缓冲液、1-3份引物、0.2-1份探针、0.2-1份热启动Taq酶、0.1-0.3份UNG酶、2-10份dNTP9和35-38份冻干保护剂。


3.如权利要求1所述的一种用于核酸扩增的冻干粉试剂，其特征在于，包括下述体积份数的原料：5份荧光PCR扩增缓冲液、2份引物、0.5份探针、0.5份热启动Taq酶、0.2份UNG酶、5份dNTP9和36.8份冻干保护剂；所述印务包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的体积比为1:1。


4.如权利要求1所述的一种用于核酸扩增的冻干粉试剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括下述原料：甘油，蔗糖，DTT，牛血清白蛋白，Proclin300，甲酰胺和ddH20。


5.如权利要求4所述的一种用于核酸扩增的冻干粉试剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括下述体积份数的原料：0.5-2份甘油，5-8份蔗糖，0.05-0.2份DTT，1-3份牛血清白蛋白，0.3-0.9份Proclin300，0.1-0.3份甲酰胺和25-28份ddH20。


6.如权利要求5所述的一种用于核酸扩增的冻干粉试剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括下述体积份数的原料：1份甘油，6.7份蔗糖，0.1份DTT，2份牛血清白蛋白，0.6份Proclin300，0.2份甲酰胺和26.2份ddH20。


7.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈大为，陈龙，李佳慧，王秀艳，孙玉凤，
申请(专利权)人：济南国益生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37