一种检测猪链球菌感染的纳米PCR方法技术

本发明专利技术公开了一种检测猪链球菌感染的纳米PCR方法。通过对纳米PCR反应体系的引物、退火温度和引物浓度进行优化，获得高效的检测猪链球菌的纳米PCR扩增体系。本发明专利技术纳米PCR敏感度比普通PCR高出100倍，本发明专利技术扩增方法最低检出限为1×10

【技术实现步骤摘要】
一种检测猪链球菌感染的纳米PCR方法
本专利技术属于分子生物
，具体涉及一种检测猪链球菌的纳米PCR引物、试剂盒及检测方法。
技术介绍
猪链球菌(Streptococcussuis，SS)是革兰式阳性菌，无鞭毛，无芽孢，可形成荚膜，菌体呈球形或卵圆形，常排列成对或者成短链，需氧或兼性厌氧。在含绵羊血或马血的琼脂培养基上形成草绿色针尖大小的α溶血菌落。根据猪链球菌的荚膜多糖的抗原特异性，分为35个血清型。猪链球菌病是SS感染导致的一种重要人畜共患传染病，主要表现以急性败血症、关节炎、脑膜炎和急性死亡为主要特征，该菌感染人后导致细菌性脑膜炎和中毒性休克，甚至死亡，给全球公共安全带来巨大隐患。欧洲、东南亚、东亚、北美、南美、澳大利亚和新西兰地区先后出现人类感染的病例，目前猪链球菌病在我国属于Ⅱ类地方性疾病，需要严格控制和快速消灭。SS主要通过直接接触传播、空气传播，也可以通过垂直传播侵害仔猪，通常经口腔或鼻腔进入机体，最终定殖于扁桃体，感染猪终生带毒，但不一定表现出临床症状，但发病后，SS进入全身，可从各组织、脏器和分泌物中分离到病原菌。由于SS血清型众多，传播途径多样，临床上多种血清型混合存在或先后存在，且SS毒力因子复杂，致病机制不明确，因此建立快速、高效的检测方法对SS的防治具有重要意义。目前，对SS的诊断方法主要有细菌分离鉴定、血清学诊断、普通PCR、荧光定量PCR等。细菌分离鉴定费时费力、过程繁琐且有时分离不到致病菌；血清学诊断方法主要用于SS血清分型鉴定，虽然简便快速，但是准确度不够高；分子学诊断技术中，普通PCR的检测是常用技术，但由于该方法灵敏度不足，在检测过程需要先进行增菌试验，核酸提取，才能进行检测，临床检测时间较长，不能满足当前的检测需求；荧光定量PCR灵敏度高，特异性好，但该方法对仪器设备要求较高，难以推广应用。近年来，随着纳米材料的发展，研究发现纳米金属颗粒能够调节DNA聚合酶的活性，高效启动DNA聚合酶，还能够提高PCR反应体系的导热性能，快速达到目的温度，使非目标温度的停留时间变短，从而减少了非特异性扩增，增加特异性扩增的产量，提高PCR的扩增效率和检测的灵敏度，同时缩短了整个PCR反应过程。该方法目前仍未适用于猪细菌检测，尤其是SS的鉴定检测当中。其中，谷氨酸脱氢酶是新近发现的一个与猪链球菌毒力相关的因子，具有高度的保守性，能够特异性检测不同血清型、不同地区分离的SS菌株，可作为SS检测的特异性基因。因此，本专利技术旨在通过SS的GDH基因，结合纳米PCR技术，建立新型的SS的核酸检测技术，试图寻求一种更高效、更快捷的检测方法，为猪链球菌的防控和检疫提供技术支撑。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测猪链球菌的纳米PCR方法。本专利技术的又一目的在于提供上述检测方法的引物。本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术第一方面，提供了一种检测猪链球菌的纳米PCR引物，所述引物的核苷酸序列如下：P1：5’-CATGGACAGATAAAGATGGA-3’；P2：5’-CAGCGTATTCTGTCAAACGA-3’。本专利技术的又一方面，提供了一种检测猪链球菌的纳米PCR试剂盒，包括前面所述的引物。根据本专利技术的实施例，还包括nanoPCRbuffer、Taq酶。本专利技术的又一方面，提供了前面所述纳米PCR引物在制备检测猪链球菌病猪链球菌中的应用。本专利技术的又一方面，提供了前面所述纳米PCR试剂盒在制备检测猪链球菌病猪链球菌中的应用。本专利技术的又一方面，提供了一种检测猪链球菌的纳米PCR方法，包括以下步骤：(1)提取样品的DNA；(2)以提取的DNA为模板，使用前面所述引物进行PCR扩增，得到扩增产物；(3)结果判定：对扩增产物进行分析，判定样品中是否含有猪链球菌。根据本专利技术的实施例，步骤(2)中所述PCR扩增体系：根据本专利技术的实施例，步骤(2)所述扩增体系反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸35s，循环30次；72℃终延伸10min。根据本专利技术的实施例，步骤(3)结果判定的方法：(1)若样品纳米PCR扩增产物大小为687bp，则判定样品含有猪链球菌。(2)若样品纳米PCR扩增产物无条带，则判定样品为阴性。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术的纳米PCR(NanoPCR)方法的最低细菌检测限比普通PCR最低细菌检测限高出100倍，具有良好的灵敏度。2、本专利技术纳米PCR扩增得到与预期的片段大小一致且特异的产物，克隆测序验证100％准确，本专利技术所述方法准确性极高。3、本专利技术方法适用于SS感染的检测，一步完成，操作简便快捷。综上，本专利技术提供的用于鉴别SS感染的纳米PCR方法具有极高的灵敏度和特异性，是一种高效的检测手段，可应用于猪链球菌的流行性调查，同时也为SS的鉴定和防控奠定基础。附图说明图1是本专利技术扩增反应退火温度的优化结果，其中M列：DL2000；第1列～第10列：退火温度51℃～60℃；第11列：阴性对照H2O。图2是本专利技术扩增反应引物添加量的优化结果，其中M列：DL2000；第1列～第14列：引物的量0.6μL～1.9μL；第15列：阴性对照H2O。图3是SS纳米PCR(A)和普通PCR(B)敏感性试验结果，其中A中M列：DL2000，第1列～第9列：1×109CFU/μL～1×101CFU/μL，第10列：阴性对照；B中M列：DL2000，第1列～第9列：1×109CFU/μL～1×101CFU/μL，第10列：阴性对照。图4是纳米PCR的特异性实验，其中A中M列：DL2000Marker，1：猪链球菌，2：副猪嗜血杆菌，3：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，4：大肠杆菌，5：沙门氏菌，6：金色葡萄球菌，7：阴性对照；B中M列：DL2000Marker，1：猪链球菌-1型，2：猪链球菌-2型，3：猪链球菌-7型，4：猪链球菌-9型，5：阴性对照。具体实施方式下面将结合说明书附图和具体的实验对本专利技术所展示的内容进行进一步详细的阐述。本实验实施过程和附图仅用于解释本专利技术，并非用于限制本专利技术的范围。实施过程中所使用的实验方法如果没有特别说明，均为常规实验方法。所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。本专利技术使用的猪主要细菌核酸包括猪链球菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和猪金色葡萄球菌，均取自广东省农业科学院动物卫生研究所猪病实验室。实施例1引物设计根据SS2-GDH(基因登录号：AY853916)基因序列进行引物设计，通过与已公开的SS-gap其他血清型的基因全长序列进行比对后筛选保守区域，通过大量筛选，筛选了灵敏度高和特异性强的引物，引物核苷酸序列如下：P1：5’-CATGGACAGATAAAGATGGA-3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测猪链球菌的纳米PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下：/nP1：5’-CATGGACAGATAAAGATGGA-3’；/nP2：5’-CAGCGTATTCTGTCAAACGA-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测猪链球菌的纳米PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下：
P1：5’-CATGGACAGATAAAGATGGA-3’；
P2：5’-CAGCGTATTCTGTCAAACGA-3’。


2.一种检测猪链球菌的纳米PCR试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。


3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括nanoPCRbuffer、Taq酶。


4.权利要求1所述纳米PCR引物在制备检测猪链球菌病猪链球菌中的应用。


5.权利要求2所述纳米PCR试剂盒在制备检测猪链球菌病猪链球菌中的应用。


6.一种检测猪链球菌的纳米PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取样品的DNA；
(2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张昆丽，李春玲，蔡汝健，杨冬霞，蒋智勇，宋帅，李艳，勾红潮，卞志标，楚品品，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44