一种检测猪传染性胸膜肺炎杆菌感染的纳米PCR方法技术

本发明专利技术公开了一种检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌感染的纳米PCR方法。通过对纳米PCR反应体系的引物、退火温度和引物浓度进行优化，获得高效的检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的纳米PCR扩增体系。本发明专利技术纳米PCR敏感度比普通PCR高出10倍，本发明专利技术扩增方法最低检出限为1×10

【技术实现步骤摘要】
一种检测猪传染性胸膜肺炎杆菌感染的纳米PCR方法
本专利技术属于分子生物
，具体涉及一种检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的纳米PCR引物、试剂盒及检测方法。
技术介绍
猪传染性胸膜肺炎是由于感染了胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)而引起的高度接触性传染性呼吸道疾病，主要表现是爆发性流行、慢性纤维素性，急性出血性，坏死性肺炎，广泛分布在全世界。APP血清型众多，不同血清型感染表现为急性和慢性两种方式，急性暴发引起的高死亡率，是当前猪场保育仔猪和育肥猪死亡的一个主要原因；慢性感染造成的猪只低增长率及酮体品质，导致的经济损失，严重阻碍了全球养猪业的健康发展。随着APP病原不断增多，多种病原混合感染，病程愈发复杂。目前，诊断APP的方法主要有细菌分离鉴定、血清学诊断、普通PCR、荧光定量PCR、原位DNA杂交等。细菌分离鉴定方法费时费力、过程繁琐且有时分离不到致病菌；血清学诊断方法虽然简便快速，但是准确度不够高；分子学诊断技术中，普通PCR的检测灵敏度仍然不能满足人们需求，荧光定量PCR和原位DNA杂交技术对仪器设备要求高，难以推广应用。近年来，随着纳米材料的发展，发现纳米金属颗粒能够调节DNA聚合酶的活性，高效启动DNA聚合酶，还能够提高PCR反应体系的导热性能，快速达到目的温度，使非目标温度的停留时间变短，从而减少了非特异性扩增，增加特异性扩增的产量。纳米材料的添加能够提高PCR检测的灵敏度，同时缩短了整个PCR反应过程，使得纳米PCR这一新型的PCR技术，逐步应用到动物疫病的检测中。纳米PCR方法目前仍未应用于猪细菌检测，尤其是APP的鉴定检测当中。毒素ApxIV是一种由15种血清型APP产生的种属特异性毒素。因此，本专利技术旨在建立APP纳米PCR检测技术，试图寻求一种更高效、更快捷的检测方法，为猪传染性胸膜肺炎的防控和检疫提供技术支撑。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测猪传染性胸膜肺炎杆菌感染的纳米PCR方法。本专利技术的又一目的在于提供上述检测方法的引物。本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术第一方面，提供了一种检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的纳米PCR引物，所述引物的核苷酸序列如下：P1：5’-TTATCCGAACTTTGGTTTAGC-3’；P2：5’-ATATTTGATAAAACCATCCGTC-3’。本专利技术的又一方面，提供了一种检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的纳米PCR试剂盒，包括前面所述的引物。根据本专利技术的实施例，还包括nanoPCRbuffer、Taq酶。本专利技术的又一方面，提供了前面所述纳米PCR引物在制备检测猪传染性胸膜肺炎中的应用。本专利技术的又一方面，提供了前面所述纳米PCR试剂盒在制备检测猪传染性胸膜肺炎中的应用。本专利技术的又一方面，提供了一种检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的纳米PCR方法，包括以下步骤：(1)提取样品的DNA；(2)以提取的DNA为模板，使用前面所述引物进行PCR扩增，得到扩增产物；(3)结果判定：对扩增产物进行分析，判定样品中是否含有猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。根据本专利技术的实施例，步骤(2)中所述PCR扩增体系：根据本专利技术的实施例，步骤(2)所述扩增体系反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸35s，循环30次；72℃终延伸10min。根据本专利技术的实施例，步骤(3)结果判定的方法：(1)若样品纳米PCR扩增产物大小为417bp，则判定样品含有猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。(2)若样品纳米PCR扩增产物无条带，则判定样品为阴性。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术的纳米PCR(NanoPCR)方法的最低细菌检测限比普通PCR最低细菌检测限高出10倍，具有良好的灵敏度。2、本专利技术纳米PCR扩增得到与预期的片段大小一致且特异的产物，克隆测序验证100％准确，本专利技术所述方法准确性极高。3、本专利技术方法适用于APP感染的检测，一步完成，操作简便快捷。综上，本专利技术提供的用于鉴别APP感染的纳米PCR方法具有极高的灵敏度和特异性，是一种高效的检测手段，可应用于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的流行性调查，同时也为APP的鉴定和防控奠定基础。附图说明图1是本专利技术扩增反应退火温度的优化结果，其中M列：DL2000；第1列～第10列：退火温度51℃～60℃；第11列：阴性对照H2O。图2是本专利技术扩增反应引物添加量的优化结果，其中M列：DL2000；第1列～第14列：引物的量0.6μL～1.9μL；第15列：阴性对照H2O。图3是APP纳米PCR(A)和普通PCR(B)敏感性试验结果，其中A中M列：DL2000，第1列～第9列：1×109CFU/μL～1×101CFU/μL，第10列：阴性对照；B中M列：DL2000，第1列～第9列：1×109CFU/μL～1×101CFU/μL，第10列：阴性对照。图4是纳米PCR的特异性实验，其中M列：DL2000Marker，1：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，2：副猪嗜血杆菌，3：猪链球菌，4：大肠杆菌，5：沙门氏菌，6:猪金色葡萄球菌，7：阴性对照。具体实施方式下面将结合说明书附图和具体的实验对本专利技术所展示的内容进行进一步详细的阐述。本实验实施过程和附图仅用于解释本专利技术，并非用于限制本专利技术的范围。实施过程中所使用的实验方法如果没有特别说明，均为常规实验方法。所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。本专利技术使用的猪主要细菌核酸包括猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和猪金色葡萄球菌，均取自广东省农业科学院动物卫生研究所猪病实验室。实施例1引物设计研究表明APP的APxIV基因在APP的不同血清型间高度保守，常作为APP的特异性鉴定位点。因此根据APP-APxIV(基因登录号：EU090171)基因序列进行引物设计，通过与已公开的APP-APxIV其他血清型的基因全长序列进行比对后筛选保守区域，通过大量筛选，筛选了灵敏度高和特异性强的引物，引物核苷酸序列如下：P1：5’-TTATCCGAACTTTGGTTTAGC-3’(SEQIDNO:1)；P2：5’-ATATTTGATAAAACCATCCGTC-3’(SEQIDNO:2)。实施例2扩增条件的优化(1)退火温度将退火温度梯度设置为51℃～60℃，退火温度间隔1℃进行梯度设置，进行退火温度的优化，反应体系和其他反应条件均相同。用P1和P2引物，进行PCR扩增反应，反应结束后取PCR扩增产物用琼脂糖电泳检测。结果：如图1所示，最佳的退火温度为52℃。最佳的纳米PCR扩增反应条件：95℃预变性4min；95℃变性30s、52本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的纳米PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下：/nP1：5’-TTATCCGAACTTTGGTTTAGC-3’；/nP2：5’-ATATTTGATAAAACCATCCGTC-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的纳米PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下：
P1：5’-TTATCCGAACTTTGGTTTAGC-3’；
P2：5’-ATATTTGATAAAACCATCCGTC-3’。


2.一种检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的纳米PCR试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。


3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括nanoPCRbuffer、Taq酶。


4.权利要求1所述纳米PCR引物在制备检测猪传染性胸膜肺炎中的应用。


5.权利要求2所述纳米PCR试剂盒在制备检测猪传染性胸膜肺炎中的应用。


6.一种检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的纳米PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取样品的DNA；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：张昆丽，李春玲，蔡汝健，杨冬霞，蒋智勇，宋帅，李艳，勾红潮，卞志标，楚品品，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44