一种肝素结合蛋白测定试剂盒及其制备和测定方法技术

本发明专利技术公开了一种应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒，包括亲和素标记的磁微粒、生物素标记的HBP抗体1、辣根过氧化物酶标记的HBP抗体2、HBP校准品、浓缩洗液和底物。本发明专利技术还公开了试剂盒的制备方法和测定方法。本发明专利技术新型免疫测定试剂盒用以体外定量测定人体液中的HBP，克服了传统酶免疫分析(EIA)法在操作方面的人为误差，并可通过定量客观反映HBP的存在，为临床诊断及疗效观察和预后判断提供更有力的实验诊断依据。本发明专利技术所提供的肝素结合蛋白测定方法特异性高，重复性好，检测灵敏度高，线性范围宽，自动化程度高，操作简便快速；与EIA法比较，具有快速、简便、准确、干扰小的优点。

A heparin binding protein assay kit and its preparation and determination method

【技术实现步骤摘要】
一种肝素结合蛋白测定试剂盒及其制备和测定方法
本申请涉及免疫测定
，尤其涉及一种应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒及肝素结合蛋白的测定方法。
技术介绍
感染性疾病是一类严重威胁人类健康的疾病。脓毒症是病死率较高的感染性疾病之一，尽早诊断及治疗对提高脓毒症疗效及预后有重要的作用，所以现在临床面临的最大挑战是如何尽早对脓毒症患者明确诊断。近年来肝素结合蛋白(HBP)被证实可以作为脓毒症早期诊断标志物之一。脓毒血症是指由感染引起的全身性炎症反应综合征(systemicinf1animatoryresponsesyndrome，SIRS)，临床上证实有感染或高度可疑感染。尽管脓毒血症是由感染引起的，但是一旦发生后，其发生及发展遵循自身的病理生理过程和规律，因此，从本质上来说脓毒血症是机体对感染性因素的反应。严重脓毒血症，是指脓毒血症并且伴有组织器官功能障碍及组织灌注不良或低血压。脓毒血症一旦发生，病情发展迅速，病死率高，给临床医疗活动带来巨大的挑战。近年来由于抗生素的不合理应用，耐药菌不断增加、糖皮质激素类药物及免疫抑本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，包括磁微粒、HBP抗体1、酶标记的HBP抗体2、HBP校准品、浓缩洗液和底物；/n所述磁微粒为亲和素标记的磁微粒；/n所述HBP抗体1为生物素标记的HBP抗体；/n所述酶为辣根过氧化物酶；/n所述HBP校准品为重组人HBP；/n所述浓缩洗液为含有Tween-20、Procline300的磷酸盐缓冲液；/n所述底物为鲁米诺。/n

【技术特征摘要】
1.一种应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，包括磁微粒、HBP抗体1、酶标记的HBP抗体2、HBP校准品、浓缩洗液和底物；
所述磁微粒为亲和素标记的磁微粒；
所述HBP抗体1为生物素标记的HBP抗体；
所述酶为辣根过氧化物酶；
所述HBP校准品为重组人HBP；
所述浓缩洗液为含有Tween-20、Procline300的磷酸盐缓冲液；
所述底物为鲁米诺。


2.根据权利要求1所述的应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述磁微粒粒径为0.9μm至1.1μm，置于储存液中储存，所述储存液为含有Tween-20、BSA、EDTA、Procline300、PEG的磷酸盐缓冲液。


3.根据权利要求2所述的应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述储存液为含有质量分数为0.5％Tween-20、1％BSA、1％EDTA、0.1％Procline300、4％PEG的pH7.4、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液。


4.根据权利要求1所述的应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述磁微粒为羧基磁性微球，所述羧基磁性微球为核壳结构，内核为介孔高分子微球，外壳为二氧化硅，磁性粒子分散在所述介孔高分子微球内部及表面，所述磁性粒子占所述羧基磁性微球总体积的1％至10％。


5.根据权利要求1所述的应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗液为含有质量分数2％Tween-20、1％Procline300的pH7.5、2mol/L的磷酸盐缓冲液。


6.根据权利要求1至5任意一项所述的应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，经免疫反应形成生物素标记抗体1-HBP抗原-辣根过氧化物酶标记抗体2的免疫反应结合物，采用所述磁微粒为载体的所述亲和素专一性捕获所述生物素，通过磁分离和洗涤，获得所述亲和素标记的磁微粒与所述免疫反应结合物形成的复合物，当加入所述底物时，化学发光物质在所述辣根过氧化物酶的催化作用下形成发光反应，样本中HBP的含量与相对发光值呈正相关。


7.根据权利要求1至6任意一项所述的应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，制备亲和素标记的磁微粒：
将磁微粒用EDC、NHS活化后与亲和素混匀，封闭液封闭，进行磁分离，所述封闭液移除后加入储存液进行储存；
步骤二，制备生物素标记的鼠抗人HBP单克隆抗体1：
生物素用磷酸盐缓冲液溶解，与HBP抗体1混合，将混匀液通过层析柱，收集生物素标记的HBP抗体，测定抗体浓度，加入封闭液旋转；
步骤三，制备酶标记的经修饰的鼠抗人HBP单克隆抗体2：
取HRP溶解于蒸馏水中，加入NaIO4水溶液，混匀，搅拌；装入透析袋中，醋酸钠缓冲液透析；加入含纯化抗体的水溶液，混匀，装入透析袋，加入碳酸盐缓冲液，搅拌透析，使之结合；加入NaBH4溶液，混匀；在以上溶液中加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，离心，去上清，沉淀以PBS溶液复溶，装入透析袋，以同样液体透析除盐12小时以上，取出离心，除去不溶物，即得酶-抗体结合物，以PBS溶液稀释后保存；
步骤四，制备HBP校准品：
将重组人HBP用含有BSA的磷酸盐缓冲液稀释成校准品；
步骤五，制备浓缩洗液：
含有Tween-20、Procline300的磷酸盐缓冲液；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王涛，姜珊，陈莹菲，洪龙斌，龚庆，姚静岚，
申请(专利权)人：中翰盛泰生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33