一种基于液相色谱串联质谱检测小蜜蜂MRJP1的方法及其在鉴别小蜜蜂蜂蜜中的应用技术

本发明专利技术涉及食品检测领域，具体提供了一种基于液相色谱串联质谱检测小蜜蜂MRJP1的方法及其在鉴别小蜜蜂蜂蜜中的应用，具体的包括：小蜜蜂蜂蜜样品前处理，搜库匹配蛋白质，特异性肽段筛选，液相色谱分离以及串联质谱检测等步骤。本发明专利技术提供的蜂蜜中小蜜蜂MRJP1的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、准确度和精确度好等优点，尤其适用于小蜜蜂蜂蜜真实性的鉴别。本发明专利技术提供的方法对遏止小蜜蜂蜂蜜的供销提供了方法支撑，同时对保护小蜜蜂这一濒危种群和维持蜜蜂基因生态多样性具有重大的现实意义。

【技术实现步骤摘要】
一种基于液相色谱串联质谱检测小蜜蜂MRJP1的方法及其在鉴别小蜜蜂蜂蜜中的应用
本专利技术涉及食品检测领域，具体涉及一种基于液相色谱串联质谱检测小蜜蜂MRJP1的方法及其在鉴别小蜜蜂蜂蜜中的应用。
技术介绍
小蜜蜂(ApisfloreaFabricius)是膜翅目蜜蜂科蜜蜂属的社会性昆虫，主要分布在北半球的热带和亚热带地区，如印度、巴基斯坦、泰国、马来西亚、印度尼西亚等。在中国，小蜜蜂主要分布在云南、贵州、广西和海南等。小蜜蜂一般栖息在海拔1900m以下，年平均温度在15-22℃的地区，在次生灌木或杂草丛中营造露天的单一巢脾。小蜜蜂蜂群较小，每年可以猎取1-2kg的蜂蜜。小蜜蜂蜂蜜营养物质丰富，口感香味俱佳，且蜂巢形状独特，出于吃“野味”的猎奇心理，云南等当地群众对其甚是喜爱。小蜜蜂属于野生蜜蜂，目前尚未人工驯化，难以规模性生产蜂蜜，因此其蜂蜜供给量非常有限，尽管售价每斤高达数百元，往往是其它蜂蜜的十几倍以上，市场依然供不应求。为了经济利益，在小蜜蜂的栖息地涌现了大量的职业性“猎蜂人”，寻找野生小蜜蜂蜂群，猎取蜂蜜。猎取过程中，多采用烟熏火燎等方式驱离蜜蜂离开蜂脾，然后取走整个蜂巢，甚至有时采用杀虫剂等毒死蜜蜂，这对蜂群造成毁灭性伤害。随着网络销售的普及，猎蜜人可以通过网络将小蜜蜂蜂蜜销售到其它地区，这使得小蜜蜂蜜蜂的需求日益增加，进而导致猎蜜活动更加频繁，最终导致小蜜蜂野生种群的破坏，乃至消亡。当前，我国小蜜蜂种群已经处于濒危状态，尽管近年来涌现了一些人工驯养小蜜蜂的技术和方法，但是距离规模化养殖和生产依然面临诸多技术难题亟需攻克。当前市场上流通的小蜜蜂蜂蜜依然是主要通过猎取野生小蜜蜂蜂巢获得。小蜜蜂作为热带和亚热带地区的主要授粉昆虫，其在维护地方生态平衡和物种多样性方面起着重要的作用。保护小蜜蜂种群，制止小蜜蜂蜂蜜的猎蜜和销售等行为尤为关键。小蜜蜂蜂蜜同其它蜂蜜一样，通过感官等方法难以鉴别其真假，如何科学准确地鉴别小蜜蜂蜂蜜，从而为后续执法等提供技术依据成为当前亟需解决难题之一。蜂蜜是蜜蜂采集蜜源植物的花蜜、蜜露等与自身分泌物相混合，经充分酿造储存在蜂巢中的天然甜味物质。小蜜蜂蜂蜜同中华蜜蜂和意大利蜜蜂酿制的蜂蜜一样，都属于植物源性物质，其中混入了少量的来自蜜蜂的分泌物，如酶类、王浆主蛋白、脂肪酸等。这些来自蜜蜂的分泌物可以用来溯源和指示酿制蜂蜜的蜜蜂品种。近年来，已经有文献报道了基于蜂蜜中的蛋白质用来鉴别意大利蜜蜂酿制的蜂蜜，或者中华蜜蜂酿制土蜂蜜。但是有关小蜜蜂蜂蜜的真实性研究尚属空白。
技术实现思路
研究发现，小蜜蜂MRJP1的含量相对恒定，据此，本专利技术重点围绕MRJP1进行研究，开发的特征肽段为小蜜蜂蜂蜜的鉴别与真实性评价提供技术和方法参考，对执法机构制止小蜜蜂蜂蜜的猎取销售等行为提供技术和方法支持，同时为保护小蜜蜂这一濒危种群具有重要的现实意义。具体而言，本专利技术的第一目的在于提供一种用于检测小蜜蜂MRJP1的特征肽段，所述特征肽段的序列为：IKEALPHVPILDR（SEQIDNo.1）。本专利技术的第二目的在于提供所述的特征肽段在检测小蜜蜂MRJP1中的应用。本专利技术进一步提供一种鉴别小蜜蜂蜂蜜的方法，包括：检测蜂蜜样品中是否含有所述的特征肽段；若含有所述特征肽段，则判定所述蜂蜜样品中含有小蜜蜂蜂蜜；若不含有所述特征肽段，则判定所述蜂蜜样品中不含有小蜜蜂蜂蜜。本专利技术进一步提供一种检测小蜜蜂MRJP1的方法，包括：在蜂蜜样品中检测序列为IKEALPHVPILDR的特征肽段。作为优选，采用液相色谱串联质谱进行所述检测，所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有m/z500.96808（[M+2H]3+）的质荷比；子离子包含质荷比为m/z613.36679和m/z946.54688的子离子，其允许偏差在5ppm以内。作为优选，采用同位素内标法对小蜜蜂MRJP1进行定量检测，其中所使用的内标肽段为：IKEALPHVPILDR*，R*表示精氨酸中所有C置换为13C，所有N置换为15N；所述内标肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子为m/z505.31199（[M+2H]3+）；子离子包含质荷比为m/z624.38288和m/z957.56297的子离子，其允许偏差在5ppm以内。蜂蜜样本中只有在精确m/z值和特异性碎片离子方面同时满足以上的特异性，方可肯定所求的该蜂蜜样本中的小蜜蜂MRJP1含量可信，可以根据此含量的高低鉴别蜂蜜质量。作为优选，所述蜂蜜样品的前处理包括：对待测蜂蜜中的蛋白进行提取，采用胰蛋白酶对所述蛋白进行酶解。作为优选，采用UHPLC-QExactiveplus或三重四级杆质谱进行液相色谱串联质谱检测。基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度。基于本方法采用的仪器和参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联高分辨质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整，上述调整均属于本专利技术保护范围。本专利技术还提供一种用于检测小蜜蜂MRJP1的试剂盒，标准物质包括所述的特征肽段。作为优选，所述标准物质还包括所述特征肽段的内标肽段，所述内标肽段为：IKEALPHVPILDR*，R*表示精氨酸中所有C置换为13C，所有N置换为15N。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：本专利技术中的特征肽段为小蜜蜂蜂蜜的鉴别与真实性评价提供了技术和方法参考。借由该特征肽段，本专利技术提供的小蜜蜂MRJP1含量的检测方法具有特异性强、灵敏度高、准确度和精确度好等优点。该方法对遏止小蜜蜂蜂蜜的供销提供了方法支撑，同时对保护小蜜蜂这一濒危种群和维持蜜蜂基因生态多样性具有重大的现实意义。附图说明图1为UHPLC-QExactiveplus提取的小蜜蜂MRJP1特异性肽段IKEALPHVPILDR的离子流；图2为UHPLC-QExactiveplus检测的小蜜蜂MRJP1特异性肽段IKEALPHVPILDR的质谱图；图3为UHPLC-QExactiveplus检测的小蜜蜂MRJP1特异性肽段IKEALPHVPILDR的二级碎片质谱图；图4为UHPLC-QExactiveplus提取的稳定同位素内标肽段IKEALPHVPILDR*(R*-13C6,15N4)的离子流；图5为UHPLC-QExactiveplus检测的稳定同位素内标肽段IKEALPHVPILDR*(R*-13C6,15N4)的质谱图；图6为UHPLC-QExactiveplus检测的稳定同位素内标肽段IKEALPHVPILDR*(R*-13C6,15N4)的二级碎片质谱图。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。1.超高效液相色谱串联四极杆/高分辨静电轨道阱质谱仪(UHPLC-QExactivePlus)，美国ThermoFisherScientific公司；2.台式低温离心机(Microfuge22RCen本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于液相色谱串联质谱检测小蜜蜂MRJP1的方法，其特征在于，在蜂蜜样品中检测序列为IKEALPHVPILDR的特征肽段。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于液相色谱串联质谱检测小蜜蜂MRJP1的方法，其特征在于，在蜂蜜样品中检测序列为IKEALPHVPILDR的特征肽段。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有m/z500.96808的质荷比；子离子包含质荷比为m/z613.36679和m/z946.54688的子离子，其允许偏差在5ppm以内。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用同位素内标法对所述特征肽段进行定量检测，其中所使用的内标肽段为：IKEALPHVPILDR*，R*表示精氨酸中所有C置换为13C，所有N置换为15N；所述内标肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子为m/z505.31199；子离子包含质荷比为m/z624.38288和m/z957.56297的子离子，其允许偏差在5ppm以内。


4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述蜂蜜样品的前...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨术鹏，李熠，傅怡，蔡冬梅，周金慧，杨宇晖，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11