一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法技术

本发明专利技术涉及反向遗传操作技术领域，公开了一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法。分别将新城疫病毒的NP、P和L基因以及表达T7 RNA聚合酶的DE3基因克隆进pXJ40载体，获得质粒pXJ40‑NP、pXJ40‑P、pXJ40‑L和pXJ40‑DE3；将新城疫病毒的全基因组cDNA克隆进pBR322质粒中得到pBR322‑DHN3；将NP基因编码区部分密码子统一替换成使用频率最高的密码子，替换到pBR322‑DHN3质粒上，形成新质粒pBR322‑mNPDHN3；采用上述5种质粒共转染BHK‑21细胞，得到拯救病毒rDHN3‑mNP。本发明专利技术方法更利于病毒的拯救和病毒致病机制的研究。

Rescue of a codon substituted Newcastle disease virus type VII

【技术实现步骤摘要】
一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法
本专利技术涉及反向遗传操作
，具体为一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法。
技术介绍
新城疫是由新城疫病毒(NDV)引起的一种主要侵害鸡、火鸡、野禽及观赏鸟类的高度接触传染性、致死性疾病，俗称鸡瘟。属高度接触性、急性、烈性传染病。人类偶会感染，表现为结膜炎。世界卫生组织(OIE)将其列为必须通报的传染病，我国农业部也将其列为必须通报的一类动物疫病。因其传播速度快且发病和病死率均可达100％，一旦波及将严重危害家禽业，造成不可估量的损失。据流行病学调查，NDV的流行基因型随时间和地理环境而变化。上世纪20-50年代主要流性I-IV型，70年代首次发现V型主要在南美和中美以致全欧洲。80年代出现VI型并盛行于中东、亚洲和欧洲。85年VII型开始蔓延，并与VIII型流行于世界多个国家并在90年代导致在亚洲、非洲和中东的大流行。V-VIII型均为强毒。IX和X型尚局限在局部散发状态。由于针对IV型的疫苗得到了广泛应用，IV型NDV已得到良好控制。但针对其它基因型的疫苗尚欠缺从而本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法，其特征在于包括如下步骤：/n(1)将新城疫病毒的NP基因、P基因和L基因分别克隆进pXJ40载体，获得辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P和pXJ40-L；/n(2)将能够在细胞中表达T7 RNA聚合酶DE3基因克隆进pXJ40载体，获得质粒pXJ40-DE3；/n(3)将新城疫病毒的全基因组cDNA克隆进质粒pBR322中，获得全基因组表达载体pBR322-DHN3；/n(4)统计新城疫病毒NP基因中编码各氨基酸的密码子的使用频次，然后将编码相应氨基酸的密码子部分替换成使用频率最高的密码子，得到密码子替换后的NP基因序列，将替换后的N...

【技术特征摘要】
20200331 CN 20201024088771.一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将新城疫病毒的NP基因、P基因和L基因分别克隆进pXJ40载体，获得辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P和pXJ40-L；
(2)将能够在细胞中表达T7RNA聚合酶DE3基因克隆进pXJ40载体，获得质粒pXJ40-DE3；
(3)将新城疫病毒的全基因组cDNA克隆进质粒pBR322中，获得全基因组表达载体pBR322-DHN3；
(4)统计新城疫病毒NP基因中编码各氨基酸的密码子的使用频次，然后将编码相应氨基酸的密码子部分替换成使用频率最高的密码子，得到密码子替换后的NP基因序列，将替换后的NP基因序列替换到pBR322-DHN3质粒上，形成新的质粒pBR322-mNPDHN3；
(5)采用步骤(1)的三种辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P和pXJ40-L，步骤(2)的质粒pXJ40-DE3和步骤(4)的质粒pBR322-mNPDHN3共转染BHK-21细胞，得到拯救病毒rDHN3-mNP。


2.根据权利要求1所述的一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法，其特征在于：所述新城疫病毒是指基因Ⅶ型新城疫病毒，其全基因组序列如序列表SEQIDNO：1；NP基因在序列表SEQIDNO：1中位置为1-1591nt；P基因在序列表SEQIDNO：1中位置为1925-3109nt；L基因在序列表SEQIDNO：1中位置为8166-15192nt。


3.根据权利要求2所述的一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法，其特征在于所述辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P通过如下方法获得：
(1)使用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pXJ40质粒，将切下的片段作为构建pXJ40-NP和pXJ40-P的质粒片段；
(2)使用引物pXJ40-NP-F和pXJ40-NP-R扩增NP基因，使用引物pXJ40-P-F和pXJ40-P-R扩增P基因，然后将扩增出的产物用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切；
(3)将步骤(1)的质粒片段分别与步骤(2)中酶切后的NP基因序列和P基因序列连接，得到辅助质粒pXJ40-NP和pXJ40-P；
两对引物序列分别如下：
pXJ40-NP-F：ACCGGAATTCGCCACCATGTCGTCTGTTTTTGACGAATACGAGC；
pXJ40-NP-R：ATATCTCGAGTCAGTACCCCCAGTCAGTGTCG；
pXJ40-P-F：ATATGAATTCGCCACCATGGCTACCTTTACAGATGCGGAG；
pXJ40-P-R：TATACTCGAGTCAACCATTCAGCGCAAGG。


4.根据权利要求2所述的一株经过密码子替换的给基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法，其特征在于所述辅助质粒pXJ40-L通过如下方法获得：
(1)使用BamHI和PstI双酶切pXJ40质粒，将切下的片段作为构建pXJ40-L的质粒片段；
(2)设计四对带同源重组序列的特异性引物，分别扩增覆盖L基因完整序列的基因片段L1、L2、L3和L4，其中片段L1的5’末端带有与pXJ40BamHI端同源的同源臂，片段L4的3’末端带有与pXJ40PstI端同源的同源臂；
(3)将步骤(2)的L1、L2、L3和L4基因片段与步骤(1)双酶切后的载体pXJ40质粒片段添加在一起，在重组酶的作用下作同源重组，得到辅助质粒pXJ40-L；
所述L1基因在序列表SEQIDNO：1中位置为8166-10709nt；L2基因在序列表SEQIDNO：1中位置为10174-12299nt；L3基因在序列表SEQIDNO：1中位置为12238-14433nt；L4基因在序列表SEQIDNO：1中位置14214-15192nt；
所述四对带同源重组序列的特异性引物序列分别如下：
pXJ40-L1-F：5’-ACTCACTATAGGGCGAATTCGGATCCGGATGGTTGGGAGGACGACATTG-3’；
pXJ40-L1-R：5’-GGACAGTTGACTCATTGCTAACATA-3’；
pXJ40-L2-F：5’-TATGTTAGCAATGAGTCAACTGTCC-3’；
pXJ40-L2-R：5’-GTGAATGTAAGGCGACACTCTGTAG-3’；
pXJ40-L3-F：5’-CTACAGAGTGTCGCCTTACATTCAC-3’；
pXJ40-L3-R：5’-CGAATATCAGGTAACACTCCATATC-3’；
pXJ40-L4-F：5’-GATATGGAGTGTTACCTGATATTCG-3’...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑞爱，王楠楠，刘定祥，黄梅，杜倩茹，叶俊贤，罗琼，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44