一种稳定肌钙蛋白I标准物质及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种稳定肌钙蛋白I标准物质及其制备方法，在cTnI稳定片段氨基酸序列基础上，转化BL21(DE3)感受态细胞，超声破碎诱导表达的工程菌获取cTnI包涵体，经1％Triton X‑100，2M脲洗涤后溶解在8M脲中，后经CM‑FF柱上复性和稀释复性纯化得到了肌钙蛋白I的标准物质。其中，所述cTnI稳定片段氨基酸序列选自cTnI蛋白序列中第30‑第110的氨基酸序列片段，所述cTnI蛋白序列如SEQ No：1所示。本发明专利技术采用了一种新方法实现了对肌钙蛋白I标准物质的制备，解决了肌钙蛋白不稳定的问题。该标准物质可在低温条件下保持长期稳定，满足国家一级标准物质的要求。该标准物质为肌钙蛋白序列的稳定片段，能够覆盖市面上多数试剂盒的抗原表位要求。

【技术实现步骤摘要】
一种稳定肌钙蛋白I标准物质及其制备方法
本专利技术涉及生物化学
，特别是涉及一种稳定肌钙蛋白I标准物质的制备方法。
技术介绍
心肌肌钙蛋白(CardiacTroponin，cTn)是心肌细胞的收缩调节蛋白，由Ca2+结合亚基肌钙蛋白C(cTnC)、原肌球蛋白结合亚基肌钙蛋白T(cTnT)、抑制亚基肌钙蛋白I(cTnI)三种亚基组成复合体，调节粗、细肌丝之间的相对滑行，从而调节肌肉收缩。心肌受损时，三个亚基被释放至细胞外，并可在外周血中检测出来，心肌肌钙蛋白是心肌损伤的特异性标志物，是心肌梗死的金指标。心肌肌钙蛋白T的试剂盒已经由罗氏公司垄断，不存在一致化的问题。但是文献报道，仅美国FDA就至少批准了15家以上的厂家生产肌钙蛋白I检测试剂盒，不同厂家的试剂盒检测同一样本结果的差异甚至可达到100倍。美国标准化研究院NIST与美国临床化学委员会(AACC)早在2001年就成立了肌钙蛋白I标准化委员会来专门做肌钙蛋白I的标准化。2005年美国NIST研制出了人心肌来源的肌钙蛋白标准物质SRM2921，在当时为肌钙蛋白I的标准化做出了很大本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种稳定肌钙蛋白I标准物质的制备方法，其特征在于：在cTnI稳定片段氨基酸序列基础上，转化BL21(DE3)感受态细胞，超声破碎诱导表达的工程菌获取cTnI包涵体，经1％Triton X-100，2M脲洗涤后溶解在8M脲中，后经CM-FF柱上复性和稀释复性纯化，得到了肌钙蛋白I的标准物质；其中，所述cTnI稳定片段氨基酸序列选自cTnI蛋白序列中第30-第110氨基酸序列的片段，所述cTnI蛋白序列如SEQ No:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种稳定肌钙蛋白I标准物质的制备方法，其特征在于：在cTnI稳定片段氨基酸序列基础上，转化BL21(DE3)感受态细胞，超声破碎诱导表达的工程菌获取cTnI包涵体，经1％TritonX-100，2M脲洗涤后溶解在8M脲中，后经CM-FF柱上复性和稀释复性纯化，得到了肌钙蛋白I的标准物质；其中，所述cTnI稳定片段氨基酸序列选自cTnI蛋白序列中第30-第110氨基酸序列的片段，所述cTnI蛋白序列如SEQNo:1所示。


2.根据权利要求1所述的稳定肌钙蛋白I标准物质的制备方法，其特征在于：所述cTnI稳定片段氨基酸序列如SEQNo:2所示。


3.根据权利要求1所述的稳定肌钙蛋白I标准物质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)人血清样本准备；
(2)稳定心肌肌钙蛋白I标准物质的制备：
1)重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞及筛选；2)重组人cTnI的IPTG诱导表达；3)重组人cTnI包涵体蛋白的裂解，洗涤；4)重组人cTnI的纯化。


4.根据权利要求3所述的稳定肌钙蛋白I标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为，将采集的人血清样本进行人类免疫缺陷病毒抗体(HIV)、梅毒、乙型肝炎表面抗原(HBV)、丙肝抗体(HCV)及常规生化全套；按照常规方法检测得到的cTnI含量，将血清样本分成低、中、高三个浓度水平，分别记为1-2-1、1-2-2、1-2-3，每个浓度水平的血清混匀后过滤至无菌滤瓶；将血清样本分装，-80摄氏度冰箱冷冻保存。


5.根据权利要求3所述的稳定肌钙蛋白I标准物质的制备方法，其特征在于：所述重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞及筛选步骤具体为，
1)从冰箱中取出一管的感受态细胞(BL21，0.5ml)迅速置于冰上，细胞在冰上融化20min；
2)将1ul的重组PET-32a质粒DNA直接加入细胞中，随后将管重置于冰中，30min；
3)42℃水浴60秒，不可摇动，迅速冰上放置5分钟；
4)加入900ul空白LB培养基，37℃，160rpm，1h，取300ul涂布卡那霉素的LB平板；
5)将平板放于工作台上数分钟以使涂布的液体被吸收，倒置，37℃培养过夜；
次日，用无菌接种环从固体平板上挑取状态好的单个菌落，接种到5ml卡那霉素抗性(K+)LB液体培养基，37℃，230rpm，12-18h，直至OD600约为0.6-0.8，其中一管加入诱导剂IPTG(终浓度为lmM)，另一管不加作对照，37℃，230rpm，5h，5000rpm，离心15min收菌，弃上清，加5ml细菌裂解缓冲液裂解菌体，5000rpm，15min，对上清、沉淀进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，鉴定目的蛋白的表达情况；筛选出表达目的蛋白单菌落；并且分析目的蛋白可溶性，-20℃保存含有重组质粒pET-32a-cTnI菌种(800ul菌液+200ul80％甘油)，作为种子液备用。


6.根据权利要求5所述的稳定肌钙蛋白I标准物质的制备方法，其特征在于：所述SDS-PAGE的具体操作方法为：
1)固定好玻璃槽，可用去离子水检查是否泄漏，配制12％分离胶，混均注入玻璃板间隙中，缓缓加入几毫升去离子水覆盖；
2)室温约30min凝胶聚合完成，倒掉覆盖水，配制5％浓缩胶，混均注入分离胶上端，小心插入梳子避免产生气泡；
3)室温约30min浓缩胶聚合，去掉梳子备用；
4)内外槽均加入lx电极缓冲液，检查是否泄漏，同时样品与上样缓冲液混合，100℃煮沸5min，3000rpm，1...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋德伟，周建平，李红梅，马凌云，肖鹏，王馨雪，刘健仪，朱文，孙浩峰，
申请(专利权)人：中国计量科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11