一种快速添加或替换目的基因的蛋白标签的方法技术

本发明专利技术涉及生物工程技术领域，公开了一种快速添加或替换目的基因的蛋白标签的方法，包括引物设计、目的基因和蛋白标签片段的扩增、表达载体双酶切及重组酶处理、转化、阳性转化子检测及测序比对。本发明专利技术在目的基因和蛋白标签的序列片段上，分别设计两对引物F1、R1和F2、R2，其中F1与R2要分别和表达载体插入位置要有至少15bp的同源臂，R1与F2之间也要有至少15bp的同源臂。目的基因片段、蛋白标签和载体片段在重组酶反应后，利用大肠杆菌转化体系就可以得到同时含有目的基因和添加蛋白标签的环状质粒，该方法适用于构建各种多标签表达载体，具有简单、快速和高效等特点。

【技术实现步骤摘要】
一种快速添加或替换目的基因的蛋白标签的方法
本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种快速添加或替换目的基因的蛋白标签的新方法。
技术介绍
蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种蛋白或多肽，主要用于目的蛋白的表达、纯化、检测和示踪等。随着功能基因组学和蛋白质组学的快速发展，越来越多的蛋白标签系统不断被发现，这也极大地丰富了蛋白标签的功能。根据试验的不同目的可以选择不同功能的蛋白标签，常用的蛋白标签有Flag、Myc、6×His、HA、GST和GFP/YFP/mCherry等。根据蛋白标签分子量的大小被分成两大类：大的蛋白质分子(或蛋白质结构域及其衍生物)和小的多肽片段。前者主要有GST(谷胱甘肽巯基转移酶)和GFP(绿色荧光蛋白)等，它们在使用过程中会增加目的蛋白的溶解性，但在蛋白结晶和抗体产生等过程中必须去除标签；后者主要有Flag(用于蛋白纯化和检测设计的多肽)、Myc(来源于人c-myc基因的表位标签)、6×His(六聚组氨酸)和HA(流感病毒血凝素表位)等，多数情况下多肽标签分子量相对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速添加或替换目的基因的蛋白标签的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：/n(1)引物设计：为目的基因和待添加或替换的新蛋白标签分别设计两对引物F1、R1和F2、R2，其中R1与F2之间要有15bp同源臂，F1和R2分别与被限制性内切酶双酶切之后的线性表达载体的两端要有15bp同源臂；/n(2)目的基因和待添加或替换的新蛋白标签片段扩增：以含有目的基因的载体为模板，以F1、R1为引物对其进行PCR扩增；同样以含有待添加或替换的新蛋白标签的载体为模板，以F2、R2为引物对其进行PCR扩增，分别扩增出目的基因片段和待添加或替换的新蛋白标签片段；/n(3)表达载体双酶切及重组酶处理：将表达载...

【技术特征摘要】
1.一种快速添加或替换目的基因的蛋白标签的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)引物设计：为目的基因和待添加或替换的新蛋白标签分别设计两对引物F1、R1和F2、R2，其中R1与F2之间要有15bp同源臂，F1和R2分别与被限制性内切酶双酶切之后的线性表达载体的两端要有15bp同源臂；
(2)目的基因和待添加或替换的新蛋白标签片段扩增：以含有目的基因的载体为模板，以F1、R1为引物对其进行PCR扩增；同样以含有待添加或替换的新蛋白标签的载体为模板，以F2、R2为引物对其进行PCR扩增，分别扩增出目的基因片段和待添加或替换的新蛋白标签片段；
(3)表达载体双酶切及重组酶处理：将表达载体用限制性内切酶双酶切得到线性表达载体，将步骤(2)获得的目的基因片段、待添加或替换的新蛋白标签片段和线性表达载体在重组酶反应体系下进行重组酶处理快速添加或替换目的基因的蛋白标签获得重组表达载体；
快速添加目的基因的蛋白标签时，线性表达载体保留表达载体的原有蛋白标签且添加新的蛋白标签；
快速替换目的基因的蛋白标签时，线性表达载体酶切去除表达载体的原有蛋白标签替换为新的蛋白标签；
(4)转化：将步骤(3)获得的重组表达载体转化大肠杆菌T1感受态并进行平板筛选获得阳性转化子；
(5)阳性转化子检测：挑取阳性转化子单克隆菌落进行扩大培养后，以引物F1、R2为引物对进行菌落PCR，将PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测后获得的目的条带进行测序；
(6)测序比对：完成目的条带测序后进行测序结果比对，若序列正确即可得到重组菌株，或者从重组菌株中提取质粒进行下一步其它试验。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的目的基因为如SEQIDNO:1所示的切除信号肽的S7-RNase蛋白基因，含有目的基因的载体为载体pCold-TF-S7-RNase；含有待添加的新蛋白标签的载体为载体p1300-35S-GFP；步骤(3)中表达载体为载体pCold-TF，用NdeI和XhoI双酶切得到线性载体pCold-TF；步骤(1)中所设计的引物序列为：
S7+GFP-F1：GGTATCGAAGGTAGGCATATGATGTACGATTATTTTCAATTTACGCAGC
S7+GFP-R1：GCCCTTGCTCACCATggatccATACTTAACATCGGCCGGGC
S7+GFP-F2：GCCGATGTTAAGTATggatccATGGTGAGCAAGGGCGAG
S7+GFP-R2：CTTGAATTCGGATCCCTCGAGGTACAGCTCGTCCATGCCG。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的目的基...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴巨友，刘雪莹，张皓，王鹏，齐开杰，谢智华，张绍铃，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32